曲美他嗪通过调控miR-26/CSE/硫化氢通路改善丙酮醛诱导的糖尿病性心肌损伤
摘要
曲美他嗪是重要的能量代谢药物，具有广泛的心肌保护作用。丙酮醛（MG）与糖尿病脏器损伤密切相关，是糖尿病心肌病发生发展的核心环节。既往研究显示，miR-26表达与心肌损伤密切相关，胱硫醚-r-裂解酶（CSE）/硫化氢（H2S）系统具有心肌保护作用。我们的前期研究表明MG可诱导心肌miR-26表达上调，减低心肌CSE活性，减少内源性H2S生成，引起心肌损伤，而曲美他嗪可缓解MG诱导的心肌损伤。本研究采用细胞生物学、分子生物学、免疫组织化学、基因组学等多学科交叉方法，通过建立H9c2心肌细胞模型和大鼠糖尿病模型，探讨曲美他嗪对心肌miR-26和CSE/H2S系统的影响及相互关系，研究曲美他嗪调控miR-26/CSE/H2S通路在MG诱导的糖尿病性心肌损伤中的作用，试图从miRNA水平和分子水平阐明曲美他嗪保护MG诱导的心肌损伤的机制，为糖尿病心肌病的防治提供实验和理论依据。
二、立论依据
（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，请附主要参考文献及出处）
一、课题的研究意义
糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy, DCM）是糖尿病患者的一种独立，不依赖心肌缺血、高血压病和风湿性心脏病等器质性心脏病心脏并发症。临床特征为心脏舒张障碍先于收缩障碍，伴心肌形态学和生化指标异常，可出现心力衰竭、心律失常、心源性休克和猝死等并发症[1,2]。糖尿病心肌病的治疗手段主要是控制血糖、控制血压、改善微循环等，总体治疗效果不佳[1]，因而进一步探索糖尿病心肌病的确切发病机制，寻找新的有效治疗靶点有重要的理论意义与临床应用价值。
近年，从代谢角度探讨糖尿病心肌病的发病机制成为研究热点，而糖基化终末产物的前体丙酮醛（Methylglyoxal，MG）是一种高活性的α-二羰基化合物，在糖尿病时明显升高，与糖尿病的多种脏器损伤密切相关，是糖尿病并发症发生发展的核心环节[4]。曲美他嗪作为一种重要的能量代谢药物，越来越多的受到医学界重视，是欧洲心脏学会专家组建议中惟一提到具有潜在的抗心绞痛的代谢药物，但是国内外有关曲美他嗪治疗糖尿病心肌病的报道并不多。因此，以MG为切入点，深入研究曲美他嗪对糖尿病性心肌损伤的潜在保护机制具有很强的可行性和研究价值。
二、国内外研究概况
1、丙酮醛是糖尿病性心肌损伤的核心发病环节，以丙酮醛为切入点是糖尿病心肌病防治的新思路和新方向
糖尿病心肌病涉及多种复杂的发病机制，包括微血管病变、心肌纤维化、间质炎症、氧化应激损伤及钙内稳态异常等，并最终导致左心室功能障碍[2]。越来越多的实验证实，AGEs的前体MG的过度生成介导了高血糖的靶器官损伤，是糖尿病血管并发症发生发展的始动因素和核心环节[4]。Oslo临床试验也提示，与血糖水平相比，糖尿病患者体内的AGEs（如MG）水平与糖尿病慢性并发症的发生发展更直接相关[5]。
高活性的MG具有细胞毒性与快速生成AGEs等生物特性，直接参与糖尿病慢性并发症的发生发展。正常人的血清MG含量仅为3.0~7.0 μg/dL，而2型糖尿病患者的血清MG含量高达16.0~27.0 μg/dL，1型糖尿病患者甚至可增高40.0 μg/dL [6]。体外实验显示：使用葡萄糖（25mM）处理血管平滑肌细胞3小时后，细胞内的MG水平可增加3.5倍，伴随氧化应激水平增加[7]。如直接使用MG处理细胞，可使血管平滑肌细胞的氧化应激水平增加，脂肪细胞中胰岛素介导的葡萄糖摄取下降，肌肉细胞内的胰岛素通路受抑制[7-10]。另外，MG可引起内皮细胞功能障碍，其机制与抑制丝氨酸-1177的磷酸化和AMPK通路有关，而MG清除剂氨基胍可以改善内皮功能[11]。新近研究发现，MG处理成年大鼠心肌细胞后，可出现心肌细胞收缩功能障碍，机制与细胞内PKBβ II通路激活有关[12]。在体实验也显示，大鼠长期喂养或静脉注射MG后，可出现体重增加、氧化应激和炎症反应亢进，并出现胰岛素抵抗等类似糖尿病的表现[13,14]；使用苯磷硫胺清除MG则可抑制糖尿病时损伤组织细胞的通路，减轻大鼠的糖尿病性血管并发症。我们前期的预实验也显示：使用100-400uM的MG处理大鼠H9c2心肌细胞24小时后，观察到MG剂量依赖地使心肌细胞存活率下降，氧化应激反应增加，线粒体膜电位（MMP）丢失，且伴明显的细胞凋亡（见工作基础）。
图1. 丙酮醛是糖尿病患者体内多种复杂因素的核心致病环节。DOI 10.1016/j.cell.2006.01.002
综合文献资料和我们前期的研究结果，异常升高的MG不仅是糖尿病和糖尿病并发症的标记物，也直接参与糖尿病心肌病的发生发展。在糖尿病患者体内一系列复杂病理状态（包括高糖血症、炎症状态、氧化应激和老化）中，MG是糖尿病组织细胞损伤的核心环节（图 1），但是MG引起心肌损伤的分子机制尚待阐明。
2、微小RNA（microRNAs，miRNAs）是阐明曲美他嗪保护糖尿病性心肌损伤机制的突破口
miRNAs是由22个核苷酸组成的非编码的小分子RNA，通过靶标mRNA的3’端非编码区（3’-UTR）区域的互补配对结合而抑制靶标mRNA的翻译或促进该mRNA的降解，从而降低靶标蛋白的表达而发挥生物学功能。近年的研究发现，miRNAs在糖尿病并发症和心血管疾病的发生机制中起关键调控作用。研究表明，miR-1和miR-133在小鼠心室肥厚中起决定性的作用，因为在动物心肌肥厚模型中，miR-1和miR-133表达都下降，而高表达miR-1则能抑制心肌肥厚相关基因的蛋白表达[15]。在高血压心脏病模型中，miR-30的表达下降与连接组织生长因子、胶原蛋白的表达增加有关，说明miR-30的表达失衡参与高血压心脏病的心肌纤维化过程[16]。miR-133特异表达于心肌和骨骼肌，在心衰和心肌肥大时，miR-133的表达下调，参与心肌肥厚过程的调控[17]。另外，胰岛细胞内表达最丰富的miR-375，可负调节葡萄糖引起的胰岛素分泌，而抑制miR-375可增加胰岛素分泌，过表达miR-375可通过减少肌侵蛋白的表达而影响胰岛素分泌[18]。
miR-26是近年来肿瘤研究领域发现的热点miRNAs之一[19]，在多数肿瘤中miR-26的表达下调，具有潜在抑制肿瘤增殖的作用。miR-26主要参与机体生长、发育和分化过程。最近有研究者开始研究miR-26与心血管疾病的关系：在压力负荷诱导的心肌肥厚中，miR-26的表达下降，负调控靶标GATA4蛋白，加重心肌肥厚[20]；在血管紧张素II诱导的心肌纤维化中，同样发现miR-26表达水平下调，靶向调控胶原I和CTGF蛋白水平升高，促进心肌纤维化的发展[21]。在腹主动脉缩窄的心肌肥厚模型，也观察到miR-26的表达水平下调，通过调节糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK 3β)加重心肌肥厚。但是，在某些病理状态如应激性心肌病和急性心肌梗死中观察到，miR-26的表达是上调的[23]。进一步研究显示，在大鼠急性心肌梗死模型和急性冠脉综合症患者中，miR-26的表达显著上调，上调的miR-26可靶向调节BMP/SMAD1通路，抑制新生血管的生成；而干扰miR-26表达，发现新生血管明显增加，心肌梗死范围减少，心脏功能改善。可见miR-26的表达和生物功能因病理状态不同而异，但miR-26是否参与MG诱导的糖尿病性心肌损伤，以及其如何影响糖尿病心肌病的发生发展至今仍不清楚。
我们预实验发现，MG处理H9c2心肌细胞后，miR-26表达明显增加，更重要的是，使用曲美他嗪处理后，可抑制MG对miR-26表达的上调（见工作基础）。因此，我们推测MG诱导心肌miR-26表达增加，影响心肌组织相关蛋白表达，进而加重心肌细胞损伤，而曲美他嗪则通过调控miR-26表达起到心肌保护作用。
3、调控胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）/硫化氢（H2S）系统是曲美他嗪糖尿病性心肌保护作用的内在机制
H2S是第3种内源性气体信号分子，具有多种重要的病理生理作用。机体内源性H2S可被多种酶催化产生，这些酶具有相对的组织特异性，其中胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase, CSE）主要在心血管系统中表达。目前，越来越多的资料证实，心肌组织的CSE/H2S系统以及外源性H2S具有广泛的心肌细胞保护作用。Bian等通过动物实验发现，β受体激动剂（ISO）可激活腺苷酸环化酶、环磷酸腺苷等，升高心肌胞浆Ca2+浓度，并增强心肌收缩力，导致室颤等心律失常的发生。同时也检测到血浆中H2S水平呈下降趋势，而给予外源性NaHS可降低室颤发生[25]。在大鼠离体灌注的心脏模型中发现，NaHS能限制心肌缺血造成心梗面积的扩大，其保护作用可被KATP通道抑制剂阻断[26]。H2S也可保护心脏对抗缺血-再灌注引起的损伤作用，通过上调H2S合成酶CSE的表达可对抗缺血-再灌注引起的心肌细胞损伤[27]。本研究小组前期的研究也发现，H2S能保护H9c2心肌细胞对抗低氧引起的心肌细胞损伤，表现为增加细胞存活率，减少细胞凋亡，其保护机制可能与抗氧化作用、抗凋亡、线粒体保护、抑制ERK1/2表达及促进热休克蛋白90表达等有关[28-30]。近年来报道，在成熟的脂肪细胞中，H2S抑制了胰岛素刺激的葡萄糖摄取， 而给予CSE抑制剂PAG可增加脂肪细胞的葡萄糖摄取[31]。提示CSE/H2S系统可能是胰岛素抵抗的调节因素之一， 这为治疗糖尿病等代谢性疾病提供了实验依据。
目前国内外研究主要集中探讨CSE/H2S系统在心肌缺血再灌注、心肌肥大和心力衰竭中抗氧化和抑制细胞凋亡的作用，而对其与糖尿病心肌病的关系报道甚少。本课题组近年来针对调控CSE/H2S系统防治高糖诱导的心肌细胞损伤进行了一系列研究，发现外源性H2S可以改善高糖引起的H9c2心肌细胞损伤，包括存活率下降，线粒体膜电位下降，炎症反应和心肌细胞凋亡等；其保护机制包括对抗炎症反应和氧化应激，调控细胞内MAPK（p38和ERK1/2）通路、瘦素/p38通路和AMPK/mTOR通路等[32-34]。
而曲美他嗪是另一类可改善高糖心肌损伤的药物。有趣的是，我们在构建的MG诱导H9c2心肌细胞损伤模型，发现心肌细胞的CSE表达下降，细胞内H2S含量降低，而使用曲美他嗪预处理的心肌细胞，内源性H2S含量升高，心肌细胞损伤改善。以上结果促使我们对CSE/H2S系统在MG诱导的心肌损伤中的作用做进一步的研究。我们推测：内源性CSE/ H2S生成减少，在MG诱导的心肌细胞损伤起到关键性作用，而曲美他嗪保护心肌细胞的作用机制可能与上调内源性H2S生成有关。
本课题的重点之一是探索曲美他嗪上调心肌细胞CSE表达下降的机理。我们预实验发现：在MG诱导心肌损伤模型中，miR-26的表达显著上调。我们对miR-26的增高特别关注，因为：1）miR-26在心肌组织表达的增加幅度较高，且与多种心血管致病因素（如心肌缺血、缺氧、心肌肥厚等）有关，其表达增加可能会加重心肌损伤； 2）更重要的是，根据生物资讯工具分析，miR-26能与CSE mRNA的3’-UTR互补结合（见图2）。因此，我们推测miR-26表达上调可能靶标CSE mRNA，使CSE蛋白表达下降。即，MG诱导miR-26表达上调可能是心肌细胞CSE/H2S系统受损的内在分子机制；曲美他嗪可能通过调控miR-26/CSE/H2S系统起到对抗MG心肌毒性的作用。
图2. 应用TargetScan 6.2预测的miR-26a/b和CTH mRNA 3’UTR序列的互补图（红色为种子序列）。注：CTH即为CSE蛋白的编码基因（Entrez Gene 1491）。
4、p38 MAPK通路是曲美他嗪对抗糖尿病心肌损伤的下游分子机制。
众多研究显示，糖尿病心肌病的共同特征之一是p38 MAPK通路激活，其结果包括炎症亢进、纤维化、ROS生成增多及细胞凋亡等[35]。在链脲霉素（STZ）诱导的糖尿病心肌病模型，磷酸化（代表被激活）的p38 MAPK表达明显增多[35]，而具有抗炎及抗氧化作用的大麻二酚在抑制p38 MAPK通路的同时，也能明显抑制炎症因子（如TNF-α、iNOS、NFκ-B）、ROS生成及细胞凋亡[36]。Shi-Yan Li等使用MG和高糖处理心肌细胞，同样发现心肌细胞ROS水平升高，细胞凋亡增多，机制也与p 38MAPK激活通路有关[37] 。我们之前的研究也证实，在高糖诱导的糖尿病心肌损伤模型中，观察到p38 MAPK通路激活，最终引起心肌细胞凋亡，而曲美他嗪预处理可通过调控p38 MAPK对抗高糖的心肌细胞毒性[32,34]。我们推测，曲美他嗪可能是通过上调细胞内CSE/H2S系统，抑制p38 MAPK通路的激活，进而改善心肌细胞损伤和心脏功能障碍等糖尿病心肌病表现。
综上所述，根据大量的文献支持和我们的预实验结果，本课题的假设是：曲美他嗪可下调心肌miR-26表达，而miR-26靶向调控CSE mRNA，使CSE表达增加，导致内源性H2S含量升高，进而减少下游的p38 MAPK通路的激活，而改善心肌细胞损伤和糖尿病心肌病的进展。本课题假设示意图（图3）如下：
图3. 本课题的假设示意图
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三、研究内容及研究方案
1、研究目标、研究内容和拟解决的关键问题
在本课题中，我们将利用丙酮醛（MG）诱发大鼠心肌病作为动物模型和MG刺激心肌细胞损伤作为细胞模型，分别从基因水平和分子水平探讨曲美他嗪对抗MG诱导糖尿病心肌病的发病机制，以及miR-26靶向调控CSE/H2S系统在心肌细胞损伤（包括细胞凋亡、炎症因子分泌、线粒体受损、氧化应激等）和心功能不全中的作用。
2.1 研究目标
1. 明确曲美他嗪对抗MG诱导的心肌损伤中，miR-26表达和CSE活性/H2S含量的动态变化；
2. 验证miR-26和CSE mRNA 3’-UTR之间的靶标关系；
3. 阐明miR-26靶标CSE/H2S系统在曲美他嗪心肌保护的内在分子机制。
4. 进一步验证CSE/H2S系统和p38 MAPK通路在曲美他嗪改善MG心肌毒性中的作用。
通过上述目标，为进一步阐明糖尿病心肌病的发病机制及曲美他嗪抑制糖尿病心肌病的作用提供新颖的实验资料。
2.2 研究内容
1.  探索曲美他嗪对MG诱导的大鼠心肌病的心肌miR-26表达、CSE活性/H2含量、p38 MAPK磷酸化和心功能不全发生发展的影响：
（1）动物实验（与正常大鼠比较）：制备大鼠MG诱导的糖尿病心肌损伤模型，然后观察曲美他嗪处理后，小鼠心肌组织内miR-26表达，CSE活性及H2S含量，p38 MAPK磷酸化水平，心肌损伤（心肌细胞凋亡、炎症因子分泌、线粒体受损、氧化应激等）和心功能不全发生发展的动态变化；
（2）细胞实验：建立丙酮醛（根据预实验结果，使用400μM MG）损伤心肌细胞（H9c2细胞）模型糖尿病性心肌损伤。在曲美他嗪处理后，分别检测细胞miR-26，CSE/H2S表达及活性，p38 MAPK磷酸化水平，心肌损伤（心肌细胞凋亡、炎症因子分泌、线粒体受损、氧化应激等）的动态变化；
2.  观察miR-26与心肌组织CSE/H2S下降及曲美他嗪在MG诱导心肌损伤之间的关系：
（1）动物实验（与正常大鼠比较）：不同时间，不同剂量，静脉注射miR-26反义核苷酸（antagomir），以干预心肌组织miR-26，然后观察以上干预对MG诱导的大鼠心肌组织CSE/H2S表达及活性、p38 MAPK磷酸化水平、心肌损伤（心肌细胞凋亡、炎症因子分泌、线粒体受损、氧化应激等）和心功能不全的影响；
（2）细胞实验：心肌细胞（H9c2细胞）预先转染miR-26抑制剂来干预miR-26，然后用MG刺激心肌细胞，观察以上干预对MG刺激后的心肌细胞CSE/H2S表达及活性，p38 MAPK磷酸化水平，心肌损伤（心肌细胞凋亡、炎症因子分泌、线粒体受损、氧化应激等）的影响；
3. 研究曲美他嗪调控心肌CSE /H2S系统与MG诱导的心肌损伤的关系：
（1）动物实验（与正常大鼠比较）：不同时间，不同剂量，使用曲美他嗪和外源性H2S（H2S缓释剂GYY 4137），然后观察其对MG诱导的小鼠心肌组织p38 MAPK磷酸化，心肌损伤（心肌细胞凋亡、炎症因子分泌、线粒体受损、氧化应激等）和心功能不全的影响。
（2）细胞实验：在MG刺激的同时，心肌细胞预先用转染p CSE腺病毒或用GYY 4137干预，观察以上干预对心肌细胞p38 MAPK磷酸化和心肌损伤（心肌细胞凋亡、炎症因子分泌、线粒体受损、氧化应激等）的影响。
4.  p38 MAPK通路与MG所致心肌损伤的关系：
在细胞水平，明确p38 MAPK通路在MG损伤心肌细胞中的作用：在MG刺激心肌细胞前，应用RNA干扰技术沉默心肌细胞的p38 MAPK或使用特异性p38 MAPK抑制剂SB 203580处理心肌细胞，观察心肌细胞凋亡、炎症因子分泌、线粒体受损、氧化应激等改善情况。
2.3 拟解决的关键问题
1. 准确测定心肌组织内miR-26表达、CSE活性剂H2S活性，确立miR-26和CSE/H2S系统在曲美他嗪保护MG诱导的心肌损伤中的作用；
2. 验证miR-26和CSE mRNA  3’-UTR靶向结合；
3. 明确miR-26、CSE/H2S对MG心肌毒性的细胞内信号转导通路（p38 MAPK）的影响‘
4. 给动物使用miR-26反义核苷酸（antagomir）的时机，疗程和剂量时本研究的关键技术问题。
2、拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析、统计学方法；
2.1 研究方法：
1.大鼠心肌损伤模型的建立：
参照文献（J. Criso′stomo，et al. Nutrition, Metabolism & Cardiovascular Diseases, 2013）介绍的方法：使用3月龄、雄性Wistar大鼠，予丙酮醛（溶解于饮水中）喂养达14周，其中丙酮醛浓度逐步增加：50mg/kg（7周），65mg/kg（4周），75mg/kg（3周）。
2. H9c2心肌细胞模型的构建：
用含MG（400μM）培养液处理H9c2心肌细胞12-48小时来模拟MG诱导糖尿病心肌病细胞模型（见研究基础）。对照组为低糖培养基培养的H9c2心肌细胞。
3. 新型硫化氢供体：
硫化氢缓释剂（GYY4137）是新型的水溶性H2S缓释供体，据文献报道（Li L, et al. Circulation, 2008），Moore实验室于2008年首先合成GYY4137，动物给药后在血液中持续更久，可维持2小时左右。而目前实验中较多使用的供体是NaHS，易氧化分解，作用不稳定。本课题使用GYY4137作为稳定的H2S供体进行实验研究，GYY4137已在Sigma公司购得（产品编号SML0100）。
4.心肌组织miRNAs表达测定：
先用Trizol试剂提取心肌总的RNA，然后取5μg总RNA，用小鼠miRNA芯片试剂盒（深圳宏信生物科技公司，产品编号AP-005）检测心肌组织miRNAs的表达谱。
5. 心肌细胞miR-26表达测定：
先用Trizol试剂提取心肌细胞总的RNA，然后取10ng RNA，经Taqman microRNA逆转录试剂盒（Applied Biosystem cat#366596），经stem-loop逆转录，随后进一步用实时PCR扩增，用小鼠Sno RNA202作为内参。
6. 心肌组织/细胞CSE基因和蛋白表达测定：
心肌组织CSE表达则分别用Western Blot和免疫荧光染色检测蛋白水平；而心肌细胞CSE表达用RT-PCR和Western Blot分别检测CSE mRNA和蛋白质的水平。
RT-PCR 检测CSE mRNA 时，将β-actin 作为内参基因。Western Blot检测CSE蛋白表达，组织和细胞匀浆先经10% SDS-PAGE电泳，转膜后用兔源CSE多克隆抗体检测CSE蛋白。
免疫荧光染色检测CSE：心肌组织先用10%中性福尔马林固定，经石蜡包埋、切片、脱蜡和抗原修复等步骤后，将组织切片与兔抗小鼠CSE的抗体孵育，然后用标有Taxes-Red的二抗结合一抗，最后用Zeiss荧光显微镜检测并拍照。荧光染色强度用Image J软件分析。
7. H2S含量的测定（亚甲基蓝法）：
收集心肌细胞并称重制备匀浆，在三角烧瓶中加入反应体系（1%醋酸锌、0.4M KH2PO4、0.05M的左旋半胱氨酸和10%的5’-磷酸吡哆醛）后，将三角烧瓶口封住，通入N237℃水浴，90分钟。再加入0.5ml的50%三氯醋酸，37℃水浴60分钟，再加入3.5ml去离子水，20mmol/L对氨基二甲基苯胺酸盐30mM三氯化铁0.4ml，室温静置20分钟后于670nm读取吸光度（A）值。配制NaHS作出标准曲线，计算出组织中H2S生成率，结果以nmol/（min.mg）表示。
8. miR-26与CSEmRNA3’-UTR靶标结合验证实验：
H9c2心肌细胞先种在细胞培养板上，细胞长满约60-80%用Lipofectamine2000先后转染CSE 3’-UTR荧光素酶靶基因报告载体和miR-26模拟体，24-48小时后收集细胞。检测荧光素酶活性并比较分析。
9. p38 MAPK的表达：
Western Blot 用Western Blot检测p38 MAPK的磷酸化。组织和细胞匀浆先经10% SDS-PAGE电泳，转膜后用兔源p38 MAPK多克隆抗体检测p38 MAPK。
10. 心肌细胞损伤检测：
细胞凋亡检测：PI染色流式细胞仪分析，使用免疫印迹法检测Caspase-3、Caspase-9的表达水平；炎症因子检测：ELISA检测IL-1β、IL-6和IL-8，免疫印迹法检测NF-κB、TNF-a表达；线粒体功能检测：罗丹明123（Rh123）染色测定线粒体膜电位，Western blot测定细胞色素C表达；氧化应激检测：DCHF-DA染色检测活性氧；GSH试剂盒检测GSH水平。
11. 大鼠心脏功能的测定：
大鼠心脏功能的测定使用压力-容量分析系统（AD Instruments，上海贸易公司）来完成，大鼠先用氯胺酮（150mg/kg）麻醉，器官插管后用定容型呼吸机（Mini Vent 845型）进行人工呼吸。然后经颈动脉插入Millar导管（SPR-839型），记录血压和心率后将导管跨主动脉瓣送入左心室，记录到稳定的左室压力-容量曲线后，打开大鼠腹腔，阻断下腔静脉以减少回心血量，连续记录压力-容量曲线（记录5-20个周期），由计算机系统计算代表心室收缩和舒张功能的参数（ESPVR和EDPVR以及CO、SV和dp/dt等）。苏木素&伊红染色计算细胞面积：在心脏切面的内1/3心肌组织，选取细胞核接近中央的、细胞间隙清楚的细胞进行心肌细胞横截面积测量，采用图像分析软件Image pro plus 4.5进行数据分析。
2.2 研究路线：
2.3 可行性分析：
1）理论上可行：
本课题组近年研究发现心肌CSE/H2S系统在心肌缺氧损伤中的关键作用，预实验发现曲美他嗪可以导致心肌细胞CSE表达/H2S下降。而本研究旨在进一步探索CSE/H2S系统下调是否参与曲美他嗪保护MG诱导的糖尿病心肌病的发生及其可能的机制。CSE/H2S系统是内源性的抗氧化系统，理论上讲如果CSE表达下降，内源性H2S含量下降，组织器官抗损伤的能力下降，会加重心肌损伤；本研究的另一主要目标是探索miR-26在MG诱导的心肌损伤中的作用。虽然我们MG诱导的心肌组织中CSE表达下降，但机制不明。由于microRNA通过抑制mRNA的翻译或促进mRNA降解，导致蛋白质表达抑制。利用生物资讯工具发现在CSE mRNA 3’-UTR含有miR-26的互补序列，所以探索miR-26在MG诱导的糖尿病性心肌损伤中的作用有理论基础。因此，本研究假设在理论上可行。
2）有较好的研究基础。
本课题组有多名基础研究经验丰富的成员组成。课题负责人有数年心血管基础研究工作的经验。以第一作者或共同第一作者发表论文6篇，其中SCI论文5篇，本课题有较好的研究基础。
3）研究设备和实验材料供给有保障。
中山大学医学院和心血管中心实验室具备本项目所需的仪器设备。本课题所需的各种试剂均能在国内从中国公司或国外公司在中国的代理购买到。
2.4 统计学分析：
定量数据组间差异用t检验或方差分析检验法，以P值小于0.05判定差异具有显著性。定性数据组间差异则用x2检验法，以P值小于0.05判定差异具有显著性。
3. 年度研究计划及预期研究结果。
2014年7月-2014年12月
1）完成microRNA芯片检测对照和MG诱导的大鼠心肌组织不同时相的microRNA的变化；
2）完成检测曲美他嗪和MG诱导的大鼠心肌组织CSE/H2S表达的动态变化，并观察动态变化；
3）完成检测对照和糖尿病心肌组织p38 MAPK表达，并且评价大鼠心脏功能。
4）完成曲美他嗪和MG刺激心肌细胞和细胞表达miR-26，CSE表达，H2S含量，p38 MAPK激活的动态变化研究；
5）完成miR-26抑制剂对曲美他嗪处理心肌细胞CSE mRNA和蛋白表达影响的观察；
6）完成miR-26抑制剂对曲美他嗪处理心肌细胞p38 MAPK通路激活的影响；
2015年6月-2015年12月
1）完成miR-26和CSE mRNA 3’-UTR结合的验证实验；
2）完成miR-26抑制剂antagomir对MG诱导大鼠心肌CSE表达，H2S含量，p38 MAPK表达和心功能影响的研究；
3）完成曲美他嗪对MG刺激心肌细胞p38 MAPK通路激活和心肌细胞损伤的影响；
4）完成曲美他嗪干预MG诱导大鼠心肌损伤，心功能影响的研究；
5）完成p38 MPK信号通路在MG引起心肌细胞损伤中作用的实验；
预期研究结果
1）从基因水平（miR-26）及内源性H2S生成（CSE/H2S系统）的角度明确MG诱导心肌损伤的发病机制；
2）阐明MG通过上调miR-26表达，影响CSE/H2S系统，激活p38 MAPK通路引起心肌损伤；
3）证实miR-26和CSE mRNA3’-UTR靶标结合；
4）进一步验证新型H2S缓释供体GYY4137可通过抑制p38 MAPK通路保护心肌细胞对抗MG诱导的心肌损伤；
四、研究基础
（申请者与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩，申请者已具备的实验条件、尚缺少的实验条件和拟解决的途径）
1.1 相关的工作基础
而课题组主要成员在建立在体心肌缺血模型及离体心肌缺血损伤模型等方面积累了较丰富的经验，熟悉和掌握现代分子生物学技术，如RT-PCR、小干扰RNA、Western blot、基因重组和转染等，这为本项目的开展提供了技术支撑。课题负责人近三年发表与本项目相关的研究论文7篇，其中以第一作者和共同第一作者发表SCI收录期刊研究论文5篇（见“研究基础部分”）。
1.2 与本项目密切相关的预实验工作
为顺利开展本项目的研究，最近我们已建立了丙酮醛（MG）损伤H9C2心肌细胞模型，并完成了下列的预实验工作，取得较好的预期效果。
（1）丙酮醛（MG）剂量依赖地引起H9c2心肌细胞损伤（细胞存活率下降，凋亡增多）
 Fig.1 Methylglyoxal (MG) dose/time-dependently causes cellsinjury (decrease viability and increase apoptosis) in H9c2 cells
注：A：应用不同浓度[200(b)、400(c)、600(d)μM]丙酮醛处理H9c2心肌细胞24h，应用CCK-8试剂盒测定细胞存活率。B：应用丙酮醛（400μM）处理H9c2心肌细胞（8、16、24）h，应用CCK-8试剂盒测定细胞存活率。C：应用Hoechst 33258核染色检测细胞凋亡水平。
*P<0.05 vs control, **P<0.01 vs control (n=3)
（2）丙酮醛诱导H9c2心肌细胞损伤CSE表达下降，miR-26表达增加
 Fig.2Methylglyoxal (200-400uM) reducesCSE activity and significantly up-regulates miR-26 expression in H9c2 cells 
#P<0.05 vs control, **P<0.01 vs control (n=3)

（3）曲美他嗪可改善丙酮醛诱导H9c2心肌细胞损伤
 
Fig.3 Trimetazidine pretreatment protects against MG-induced cellular injury in H9c2 cells
注：A：应用罗丹明123染色检测线粒体膜电位（MMP）水平，荧光显微镜下随机选取5个不重复区摄片，用Image J 1.410软件计算出5个视野绿色荧光强度的平均值。Hoechst 33258核染色检测细胞凋亡水平。MG组：400μM MG处理24h；曲美他嗪预处理+MG组：200μM曲美他嗪预处理90 min，随后，400μM MG处理24 h；曲美他嗪：单独200 μM 曲美他嗪预处理90min。
B：应用不同浓度（50、100、200μM）曲美他嗪 预处理H9c2 心肌细胞90min，应用CCK-8 试剂盒测定细胞存活率，LDH 试剂盒测量细胞内LDH 水平。*P<0.05 vs control（n=3）

1.3 与本项目有关的主要论文（*为共同第一作者）
1. Zhuang X, Hu X, Long M, Dong X, Liu D, Liao X. Exogenous Hydrogen Sulfide AlleviatesHighGlucose-inducedCardiotoxicityviaInhibitionofLeptin-p38MAPKPathwayinH9c2Cells.Mol Cell Biochem. 2014  IF 2.35
2. Zhuang X, Long M, Li F, Hu X, Du Z, Liao X*. PDE5 inhibitor sildenafil in the treatment of heart failure: A meta-analysis of randomized controlled trials, Int J Cardiol 2014, doi.org/10.1016/j.ijcard2014.01.102   IF 5.53
3. Chen Y*, Zhuang X*, Xu Z, Lu L, Guo H, Wu W, Liao X*. Higenamine Combined with [6]-Gingerol Suppresses Doxorubicin-Triggered Oxidative Stress and Apoptosis in Cardiomyocytes via Upregulation of PI3K/Akt Pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2013; 2013:970490. doi: 10.1155/2013/970490  IF 4.72
4. Peng L*, Zhuang X*, Liao L, He X, Li J, Chen X, Lu G, Ma H, Gao X. Changes in cell autophagy and apoptosis during age-related left ventricular remodeling in mice and their potential mechanisms. Biochem Biophys Res Commun. 2013 Jan 11;430(2):822-6. doi: 10.1016/j.bbrc.2012.11.062. Epub 2012 Nov 29  IF 2.52
5. Zhuang X, Long M, Li CL, Hu CH, Du ZM*, LiaoXX*. Efficacy and Safety of Low-Dose Clopidogrel after 12-month Dual Antiplatelet Therapy for Patients having Drug-eluting Stent Implantation. J Thorac Dis (2014) ACCEPTED
6. 庄晓东,廖新学. p38 丝裂原活化蛋白激酶在糖尿病心肌病发病过程中的作用[J].中国病理生理杂志,2013 (10):1859-1863.
7. 赵斌,王礼春,庄晓东,廖新学.缺氧易化快速起搏引起的心室肌细胞钙瞬变交替[J].中国病理生理杂志2012,28(8):1405-1409.