曲美他嗪联合骨髓间充质干细胞对心肌微环境的影响及抑制心肌细胞凋亡的机制探讨
摘要
本研究设想曲美他嗪联合骨髓间充质干细胞（BMSCs）将对心肌微环境产生重大影响，可抑制心肌细胞及BMSCs的凋亡，并促进BMSCs向心肌细胞分化，最终使BMSCs移植对心肌梗死的治疗效果得到更进一步加强。本研究将建立心肌细胞和BMSCs的间接共培养体系，并通过缺氧诱导心肌细胞凋亡，观察曲美他嗪对凋亡心肌细胞微环境的影响及探讨其可能机制。建立心肌梗死模型，观察曲美他嗪联合BMSCs移植治疗心肌梗死的效果，探讨曲美他嗪在移植后对心肌凋亡的影响及机制。为以后曲美他嗪联合BMSCs治疗提供理论依据。
二、立题依据
随着药物治疗和心脏介入手术技术的提高，急性心肌梗死的死亡率明显下降，但是心肌梗死后心力衰竭的发病率却居高不下，已成为威胁人类健康的主要疾患之一。目前研究认为心肌梗死治疗的关键是坏死心肌细胞的取代与清除，缺血部位新血管的形成以保证氧气和营养的供应，避免缺血面积的扩大和缺血心肌细胞的继续凋亡[1]。而细胞移植采用生物学技术将多种组织来源的细胞，进行自体心肌内移植，替代、修复或加强受损的心肌组织的生物学功能。细胞治疗已成为治疗心肌梗死的一种颇有前景的方法。到目前为止，用于细胞移植的细胞主要有胎儿心肌细胞、造血干细胞、骨髓干细胞、骨骼肌干细胞、多能干细胞等。
骨髓间充质干细胞（Bone marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs）作为骨髓干细胞的重要成员，其取材方便，具有高度自我更新能力和多向分化潜能，同时可促进血管新生，自体细胞移植时无免疫排斥反应，不存在伦理问题等优势，已成为缺血心肌内细胞移殖的优良供体。研究表明，BMSCs在不同的体外条件下可诱导分化为骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经细胞、上皮细胞、血管内皮细胞、心肌细胞等[2]。最近几年已有很多学者对BMSCs诱导分化为心肌细胞进行了研究，但对其机制还不甚清楚，目前认为，干细胞进入微环境后对分化信号反应受周围正在进行分化的细胞影响，对新的微环境中调节信号做出反应，即“环境诱导分化” [3]。实验表明环境诱导分化可能与细胞接触[4-5]、基因水平调控[6]、细胞因子调控[7]等有关，其具体机制尤其是分子生物学上的机制尚未清楚，需要进一步研究探讨。体内动物试验[8-11]中证实BMSCs移植于小鼠、大鼠、小型猪等动物的心脏后，可存活、增殖并分化成心肌细胞，促进血管新生，防止左室重塑，提高心功能，对心肌损伤的修复特别是心脏功能的改善有显著治疗作用，在缺血心肌细胞的再生和修复上表现出较大的潜能。但是单纯细胞移植，即便是心肌内注射，移植后的细胞也很难重建损伤的心肌微环境，如心肌局部的血液灌注以及细胞间的相互作用等，由于心肌梗死区以及心梗周边区域血液供应不良，缺血缺氧严重，不能有效地保证移植细胞的存活和分化，需要进一步提高BMSCs的功能。
近年来，越来越多的文献报道，曲美他嗪作为哌嗪类衍生物，是一种新型的影响心肌代谢类药物，通过抑制线粒体内长链3-酮酰辅酶A 硫解酶而抑制游离脂肪酸B-氧化， 增强葡萄糖的有氧氧化，使心肌对脂肪酸的利用率降低，维持ATP的水平，从而优化心肌能量代谢；也可通过抑制N a+ 、C a2 + 的超载、抑制氧自由基的产生、减轻细胞内酸中毒，保护细胞膜稳定性，从而起到保护心肌细胞的作用，在心肌保护方面具有良好的临床应用价值[12]。TMZ 作为一种细胞保护因子可通过维持心肌线粒体功能, 增加ATP合成, 改善缺血后心肌组织的能量代谢; 同时它还可以减轻氧自由基对心肌的损害, 从整体上促进了心功能的恢复。对缺血心肌病病人明显减少了缺血事件的发生[13] 。在动物缺血再灌注损伤中具有抗心肌细胞凋亡的作用[14] 。研究发现曲美他嗪能明显抵抗缺氧/复氧诱导的细胞凋亡。而且发现其抗凋亡的作用与增加bc-l 2蛋白及bc-l 2 mRNA表达和降低bax、cy tochrom e C、caspase-3蛋白及caspase-3mRNA 表达有一定的关系[15]。然而，曲美他嗪对整个心肌微环境的变化，如细胞因子、炎性因子、凋亡因子等多因素的变化的影响尚未阐明，对于其具体作用机制仍有待进一步研究。
因此，本研究设想曲美他嗪联合BMSCs将对心肌微环境产生重大影响，可抑制心肌细胞及BMSCs的凋亡，并促进BMSCs向心肌细胞分化，最终使BMSCs移植对MI的治疗效果得到更进一步加强。本研究将探讨曲美他嗪对心肌细胞微环境的影响及抑制心肌细胞凋亡的可能机制，为今后联合BMSCs治疗心肌梗死提供理论依据及实验基础。
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三、研究目标与研究内容
（一）研究目标：
1.建立BMSCs与心肌细胞的共培养体系及心肌缺氧模型，观察曲美他嗪及BMSCs对心肌微环境及心肌细胞凋亡的影响。
2．建立大鼠心肌梗死的模型，观察曲美他嗪对细胞移植的影响；分析曲美他嗪和细胞移植治疗联合应用的可行性及效果。
（二）研究内容：
1. 探讨BMSCs的分离、纯化、扩增及鉴定的适宜条件及方法。
2. 探讨心肌细胞的分离、培养及鉴定的适宜条件及方法。
3．建立BMSCs与心肌细胞的共培养体系模，体外拟心肌缺氧微环境，检测曲美他嗪及BMSCs对心肌微环境的影响，探讨曲美他嗪抑制心肌细胞凋亡的可能机制。
4．建立大鼠心肌梗死的模型，进行细胞移植。观察移植细胞的滞留、存活及分化情况；观察移植前后大鼠心功能等多项指标变化；分析曲美他嗪和细胞移植治疗联合应用的可行性及效果，探讨曲美他嗪在移植后对心肌凋亡的影响及机制。
四、研究方案
（一）研究对象：SD大鼠
（二）研究方法
1.采用贴壁筛选法对SD大鼠的BMSCs进行分离、纯化及扩增。
2.流式细胞仪检测BMSCs表面标志物，如CD29、CD34、CD44、CD45、CD90等。
3.采用差速贴壁分离法及化学试剂抑制法分离、纯化新生SD大鼠的心肌细胞。
4.采用transwell建立间接共培养体系。
5.采用厌氧罐模拟细胞缺氧，诱导体外培养的心肌细胞凋亡。
6.心肌细胞凋亡的检测：TUNEL染色、Annexin V/PI双染色流式细胞仪检测CM凋亡率
7.液相蛋白质芯片系统检测培养液中凋亡因子、炎症因子、细胞因子等微环境的变化。
8.Western blotting检CM中caspase3、bcl-2、Bax、Akt、Erk、Mek的表达。
9. 建立大鼠心梗模型：左冠状动脉前降支（LAD）结扎。
10. 将GFP标记的BMSCs通过心脏内注射进行细胞移植，活体成像系统观察移植细胞的移植后存活细胞的定位、分布等情况的检测；超声心动图检测、血流动力学检测大鼠心功能变化情况；TUNEL染色检测细胞凋亡情况；免疫组化染色检测心梗面积、新生血管密度、细胞分化情况。
（三）技术路线
 

 
（四）统计学方法
使用SPSS18.0统计软件进行分析。组间差异使用配对t检验或方差分析进行统计学分析。