曲美他嗪改善严重冠脉狭窄后缺血心肌血流储备的实验研究
摘要
正常冠脉循环被诱发充血时，冠脉血流量的增加主要源于毛细血管的开放数量增多(增募)和毛细血管床的容积扩大。当冠脉发生严重狭窄时，心肌血流量的减少主要源于毛细血管床的关闭（容积减少)，而非冠脉狭窄本身。研究表明，曲美他嗪能改善心肌微循环的缺血、缺氧，其原因在于其能抑制3-酮酰辅酶A硫解酶而抑制心肌脂肪酸B氧化,增加葡萄糖氧化,改善糖酵解与糖氧化耦联,优化心肌细胞能量代谢有关。其机制与减少细胞内Ca2+的超载,抑制氧自由基生成,稳定线粒体膜功能状态,抗氧化、抗凋亡等多种细胞保护作用有关。但在严重冠脉狭窄时曲美他嗪是如何是如何影响冠脉分值血流储备的？此时心肌毛细血管床的容积是如何变化的？目前尚未有定论。 本研究拟对此进行研究，为曲美他嗪改善心肌微循环治疗的提供实验依据。
二、立论依据
  正常冠脉血流可以满足任何情况下心肌对氧的需求，如在运动、 神经内分泌激活或药物引起充血刺激的情况下, 冠脉血流可自动地由休息时的水平增加到最高水平，这种由基础到最大血流的增加称为冠脉血流储备(Coronary flow reserve, CFR)。冠脉循环的这种血流调节功能主要是通过心外大冠脉(epicardial vessel)（Rs）、冠状小动脉(small arteries)和微动脉(arterioles)（Ra）以及心肌内毛细血管(intramyocardial capillary system)（Rc）等3个主要的阻力成分（Rs、Ra、Rc）来实现的。在没有动脉粥样硬化的静息情况下，Rs是轻微的， 约60%的心肌血管总阻力(Myocardial vascular resistance,MVR)是由直径＜400μm的微动脉提供的（Ra）,其余25%由毛细血管提供(Rc)，15%由小静脉提供(Rv) [1]（见图1）。
当正常冠脉循环被诱发充血（hyperaemia）时, 平滑肌舒张引起小动脉和小静脉扩张, 与静息相比，小动脉和小静脉阻力各减少86%和98%，总心肌血管阻力(MVR) 减少68%。由于小动脉和小静脉的阻力相似程度地减少，使毛细血管的静水压力(hydrostatic pressure)保持不变；与此同时, 毛细血管的开放数量增多(增募，recruitment)，毛细血管床的容积扩大, 致使充血状态下的冠脉血流量(Coronary blood flow, CBF)增多[2]。
当存在冠脉严重的狭窄时，狭窄对血流的阻力引起狭窄远端的压力丢失，从而通过狭窄段形成压力阶差，致前向血流减少。但由于狭窄冠脉远端小动脉的代偿性扩张和毛细血管床的扩容(征募)， 使静息时毛细血管床的灌注压仍可能保持不变，心肌可无明显缺血表现； 然而，当冠脉循环被诱发充血时， 整个冠脉微血管床的阻力减少，使血流由相对阻力高的狭窄冠脉供区心肌流向阻力更低的心肌； 同时， 血管扩张剂使通过狭窄区的血流速度增加， 跨狭窄区的压力阶差增大， 通过狭窄后冠脉的灌注压更为下降， 此时，为保持毛细血管床的灌注压, 狭窄冠脉供区心肌的部分毛细血管床关闭(减少征募)，使心肌中的毛细血管床容积减少从而形成影像上的灌注缺损及临床上的心肌缺血[1] 。故在冠脉狭窄时, 冠脉血流量（CBF）减少主要来源于毛细血管的阻力增大，即容积减少, 而不是冠脉狭窄本身[3]。
图1显示在基础(baseline)和负荷(hyperaemia)状态下，正常冠脉（左图）和狭窄后冠脉（右图）循环各部分阻力的分布情况.。Rs、Ra、Rc、Rc分别代表心外大冠脉、微动脉、毛细血管和小静脉的阻力
为此，Kern和De Bruyne [4 ] 精辟地提出将整个冠脉循环分为两个部分的模式：心外部分和心肌微血管部分（Epicardial vs microvascular compartments）（见图2）。静息时心外冠脉如左前降支（LAD）血流为 ±60-100ml.min-1, 最大LAD血流可达 ±300-500ml.min-1；静息时心肌血流为 ±1ml.min-1.g -1，最大
图2 冠脉循环的两室模式
心肌血流可达 ± 4-6ml.min. g-1。人们对冠心病的评价也因而由单纯重视管腔和管壁，发展到重视冠状动脉微血管床的血流储备能力。早在约35年前, Eugene Braunwald 就提出了一个革命性假说：时间就是心肌，时间就是结果，对AMI来说，心肌微循环血流与预后最为相关[5]。同时，根据临床研究, 约有1/5至1/3的AMI患者, 经及时心外冠状动脉重建使梗死相关的冠状动脉(IRA) 血流达TIMI 3级后, 心肌出现无复流（no-reflow）现象，即心肌微血管床未得到再灌注，这些患者同时具有左室整体收缩功能减退、恶性心律失常、难治性心力衰竭、进行性左室重塑、心脏破裂和高死亡率等不良后果[6]。对此临床上采用了一系列的药物治疗，希望改善这部分病人的长期存活率和远期预后，遗憾的是，均为取得理想的效果。
最新临床研究表明，心肌肌缺血是一种代谢病。曲美他嗪(万爽力)为哌嗪类衍生物,是一种新型的抗心肌缺血药，是心血管病治疗的重要辅助药物。其主要通过抑制3-酮酰辅酶A硫解酶而抑制心肌脂肪酸B氧化,增加葡萄糖氧化,改善糖酵解与糖氧化耦联,优化心肌细胞能量代谢。尤其是对缺血心肌的作用明显[7]。目前主要用于心绞痛和心功能不全的辅助治疗。大量基础研究证实，万爽力能减少细胞内H+、Na+、Ca2+的超载,抑制氧自由基生成,稳定线粒体膜功能状态,具有抗氧化、抗凋亡等多种细胞保护作用,且不影响血流动力学,无副性肌力作用[8]。Mody等[9]采用发现对冠脉结扎的兔模型给予曲美他嗪, 然后使用正电子扫描成像技术观察缺血心肌组织葡萄糖的代谢率，缺血区周边心肌组织葡萄糖的代谢率得到显著升高。
 传统的抗心肌缺血药物主要是通过改变血流动力学，最终减少心肌的氧耗来改善心肌缺血。曲美他嗪则是通过提高氧利用，保证心肌的氧化供能，提高静息状态下心脏的机械效能，减轻了运动过程中心肌缺血的程度，最终提高了缺血阈值。心肌缺氧时会导致脂肪酸代谢增加，这就降低了心肌做功的机械效能。曲美他嗪可以使心肌耗能的优先底物从脂肪酸转向葡萄糖代谢，从而提高心肌的机械效率。 Feola等通过核素显像技术，发现曲美他嗪能通过改善心肌代谢来减少冬眠心肌的面积，最终改善左室功能[10]。
有关曲美他嗪的系列研究结果，促使我们想进一步探讨应用曲美他嗪，通过能量代谢途径是否能改善严重狭窄冠脉后缺血心肌的血流储备，这是一个尚未得到明确的问题。为精确评价和探讨曲美他嗪对缺血心肌微血管床血流的影响，我们准备采用分值血流储备的测定和心肌声学造影等两种方法。
分值血流储备（Fractional flow reserve, FFR）是目前认为评估具体冠脉及其所属心肌微血管床局部血流储备的最好方法[11]。心肌灌注压（冠脉舒张压）等于主动脉压减去左室舒张压或中心静脉压。正常时主动脉压力可完全不丢失地传送到冠状动脉全程，直到心外冠脉的最远端；当冠脉存在动脉粥样硬化性狭窄时，远端冠脉压力下降与狭窄阻力的程度相关；Pijis等[12]将冠脉狭窄远端压力与缺血程度相关联；在最大充血状态（使微血管阻力达到最小限度和一致）计算狭窄远端和主动脉压力比值（distal coronary pressure/aortic pressure的比值）作为正常灌注压， 可测定正常冠脉血流的比率, 或正常冠脉血流的分值（FFR）。在临床实践中，FFR可用简单的计算方法：FFR ≈ Pd / Pa， 其中 Pa代表平均主动脉压力； Pd代表平均冠脉末段（或狭窄末段）压力。与其他生理指标不同，FFR的正常值在每一个病人和每一条冠脉均为1.0。FFR＜ 0.75 表明具有可诱发性心肌缺血 (特异性, 100%), FFR＞0.80 表明大多数病人缺乏可诱发性心肌缺血 (敏感性,90%)[13]。以血管内超声（IVUS）所测的狭窄冠脉截面积4mm2为严重狭窄的临界点对比，同样的4mm2情况下，可因血管的大小、灌注心肌的领域、是否有侧支循环以及病变的数量和长度等不同而测得不同的FFR值，因此，FFR反映的不仅是狭窄冠脉的阻力（Rs），同时还反映了心肌微血管床的阻力（Ra、Rc）。
心肌声学造影(Myocardial contrast echocardiography, MCE)是测量微循环血流的理想方法，因为它有很好的空间和时间分辨率；同时，微泡具有与红细胞相似的血管内流变学特点[14]，对超声有很好的散射，可跟踪红细胞通过组织，可视作红细胞的示踪剂。将微泡持续输入2-3分钟后，当它们在血池中(左室腔或心肌)的浓度恆定，且和血池的血液容积分数构成比例时，形成微泡的稳定状态。 例如，在正常情况下，如左室腔容积样本中有100个微泡，则心肌的血容积样本中就有8个微泡(正常时接近8%的左心室重量是由微血管床组成)，将心肌声学强度减去本底 (心肌组织)，再与左室声学强度正常化后就能提供心肌容积(Myocardial blood volume, MBV)的分值(因左室为100%的血液)；由于MBV中90%由毛细血管组成，故MCE提供的是不同区域心肌中的毛细血管密度。应用高机械指数(MI)破坏心肌中的微泡，测定微泡在心肌内再充填的速率。可产生不同心肌区域的时间-声强(AI)曲线，该曲线符合指数功能: y＝A(1－e-βt), y 代表不同脉冲间隔的AI,  A代表平台时的AI,  β速率常数代表AI升高的速率(表明微泡增加的速度)[3]。这种评估心肌灌注的方法最主要的优点是能同时测定心肌血流(MBF)速度和心肌血液容积(MBV),后者由A来表示。将正常化的A除以LV腔的AI可提供MBV分值的测量。 MBV分值和MBF速度的乘积可估计MBF。一般主张在收缩末期进行测量，因为在此周期中，心肌内的较大血管血液已排空，主要的MBV是毛细血管,该处是营养性MBF的部位。
综上所述，综上所述，本研究拟对犬急性单支冠脉血流限制性狭窄模型，观察使用大剂量万爽力对 FFR测值的影响。在此基础上评价万爽力在急性冠脉缺血中的应用价值，期望有所突破，为开拓其改善心肌微循环治疗的领域提供实验依据。
参考文献（下划线部分为本课题组发表文章）
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（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，请附主要参考文献及出处）
 
三、研究内容及研究方案
1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题；
2. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析、统计学方法；
1．研究目标、研究内容和拟解决的关键问题
研究目标：
（1） 证明曲美他嗪能够改善急性冠脉狭窄后引起的供区心肌灌注和分值血流储备的降低；同时证明这种改善还与心肌能量代谢的改善相关；
（2） 通过组织病理学、炎症反应、氧化应激、心肌细胞凋亡等多个方面阐明曲美他嗪改善缺血心肌血流储备的相关可能机制，为急性冠脉综合症的心肌保护提供新的思路和手段。
 研究内容
（1）对急性严重单支冠脉血流狭窄患者，利用分值血流储备测定和心肌声学造影技术，测量窄后冠脉压力、供区的心肌灌注、心肌血流、血流储备以及微循环阻力的变化，并观察盐酸曲美他嗪对其影响；
（2）通过组织病理学（细胞超微结构变化），炎症反应因子如白介素-6（IL-6）、白介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子（TNF-?），氧化应激如超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA），以及心肌细胞凋亡等多个方面阐明曲美他嗪改善缺血心肌血流储备的相关可能机制，为急性冠脉综合症的心肌保护提供实验支持。
拟解决的关键问题
（1）制备稳定的冠脉血流限制性狭窄的动物模型：本实验室与日本国立循环中心心血管内科、大阪大学廖禹林教授建立了合作关系，实验中使用的犬前降支血流限制性狭窄人工旁路模型是在其指导下设计的。冠脉狭窄的程度稳定，测得的数据重复性好，结果可靠。
（2）保证实验各项血流动力学指标、心肌声学造影指标和放射微球等技术的稳定性和重复性。
2. 拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析、统计学方法；
2．1研究方案
一、动物模型制备
（1）麻醉及插管
实验犬以30mg/kg的戊巴比妥钠麻醉后，气管插管，呼吸机辅助呼吸, 间断血气分析调整呼吸机参数并维持电解质平衡。行双侧股静脉插管，一侧建立静脉通道，用于补液及注射造影剂，一侧插入6F猪尾导管至右心房测压。双侧股动脉插管，一侧插入6F猪尾导管至主动脉根部，用于测量主动脉压力和血气分析, 另一侧用于放射性标记微球的参考样品的抽样通道。行右侧肘静脉插管，作为输入选择性腺苷A2A受体拮抗剂的通道。另外在左心房建立注射放射微球的通道。
（2）急性前降支(LAD)血流限制性狭窄模型的制备
游离左侧颈动脉，于第四肋间行胸廓切开术，悬吊心包床。游离近段LAD，建立左颈动脉与LAD之间的桥通道（如 图3所示），颈动脉内的血液通过人工的体外旁路管（extracorporeal bypass tube）进入到LAD内。在人工管道的近端放置冠脉定量缩窄器（Research Products International Corp.），调节缩窄器，制造血流限制性狭窄使血流量减低。于人工管道的中段安置多普勒血流计(Transonics Inc.Ithaca, NY),测量狭窄后的血流速度。人工管道的末端接三通，侧孔接压力换能器以测量狭窄后的冠脉压力。在左回旋支（LCX）的中段安置多普勒血流计，监测LCX的冠脉血流。
图3  犬前降支血流限制性狭窄人工旁路模型
模型制备完毕后稳定15min，待心率、血压平稳后通过两组压力测量系统，同步记录升主动脉压力和桥末端的冠脉灌注压（相当Pd/Pa），在未造成桥血管狭窄前，Pd/Pa=1；
调整冠脉缩窄装置使窄后血流量降低90%左右，稳定15分钟后，从右侧肘静脉以0.3μg/kg/min的速度输入ATL146e（Adenosine Therapeutics, Inc, Charlottesville, VA），观察Pd/Pa变化，当Pd/Pa＜0.80，且主动脉压力下降不超过20mmHg时，为模型建立成功。
二、心肌声学造影(MCE)
（1）造影剂准备
微泡造影剂为南方医科大学南方医院药学部提供的5%白蛋白全氟丙烷微球注射剂(国家生物制品I类新药证书编号：S20660055)，微泡直径约为2.5～4μm，每瓶注射剂约含2.0×109个微气泡，具有和红细胞相似的血流动力学特性，实验时以3ml生理盐水溶解并摇匀后使用。把1.5ml的微泡加入到30ml的生理盐水中，以120-160ml/h的速度静脉滴注。
（2）造影图像采集
采用二次谐波成像系统(send/receive 1.75/3.5 mHz, Sequoia, Siemens Corp.)，选择左室短轴切面,在乳头肌水平对犬实施开胸的声学造影成像。在持续静滴造影剂的过程中，在犬心室收缩末期逐渐延长触发间隔，实行心电图门控的心肌声学造影。在初条件最佳化以后，增益、深度、机械指数(0.8–1.0)、焦点和测量范围都保持恒定。
（3）图像分析
采用MCE图像分析系统（Virginia University, USA）对图像进行脱机分析。选择造影前的左室短轴切面图像作为“本底”图像，分别勾画出LAD和LCX对应的缺血区域的兴趣区各一个（选择兴趣区时避开心内膜、心外膜、乳头肌）。在自动对图的基础上手工对齐不满意的图像。绘制声学强度随脉冲间隔变化曲线，利用函数y =A×(1-e-βt)进行拟合。其中y代表声学强度，而t代表触发间隔。每一次发放的超声脉冲都被认为是线性地破坏微泡。在一定的触发间隔时间内，微泡以和红细胞成比例的速度进入成像区域。触发间隔进一步延长，微泡会完全占据成像区域，声学造影强度也达到一个峰值A。A的大小由收缩或舒张末期时心肌血液中的最大微泡浓度所决定,而β速率常数则代表声强升高的速率（表明微泡增加的速度）。所以，A代表毛细血管容积，A?β代表心肌血流量。最后，通过把每个像素单元的声学强度转化成与造影剂信号成比例的红、橙、黄、白颜色，就可以对除去本底的图像进行彩色编码，进而显示局部灌注缺损。
三、放射微球测量心肌灌注
将总数为3×106个99mTc标记的放射性微球悬浮于4ml生理盐水和0.01%的混合液，从动脉插管注入LAD近段开口。注射微球前10s开始用恒速泵匀速抽取参考血样，速度5ml/min，微球注入时间60s，抽血持续时间180s。实验结束后立即用10%的氯化钾20ml处死实验犬，取出心脏，根据超声心动图对应位置及Evans蓝染色（参见下文）情况分别切取心脏缺血区和正常区组织块各3块，应用多通道γ计数器（Packard Instruments Inc.）分别测量参考血样及组织块放射强度，根据公式Qm =(Cm?Qr)/Cr计算各区域心肌血流量，其中Cm代表心肌样本组织块的放射性计数；Qr代表抽取动脉参考血样的速度（ml/min）；Cr代表抽取动脉参考血样的放射计数。每一个区域心肌血流量=3块标本血流量总和/3块标本的总重量（ml/min/g）。必要时加用131I标记的放射性微球，具体实施过程同上。
四、测量冠脉微循环阻力
根据阻力＝压力差/血流量的原理，我们可以得到冠脉微循环的阻力。从LAD人工旁路模型得出狭窄后的冠脉压力，从右房留置导管内近似得到冠状窦的压力，同时结合“金标准”－－放射微球测定得到的心肌总灌注的血流量，LAD窄后压力与右房压之差与心肌总灌注血流量的比值即为LAD血管床的微循环阻力。比较正常基础状态下、冠脉狭窄90％后的微循环的阻力变化，评价药物的治疗效果。
2.2技术路线
（1）36只犬，分为3组（每组12只）：冠脉狭窄组、冠脉狭窄加曲美他嗪组、冠脉狭窄加安慰剂组；
（2）3组均制作动物模型，待动物状态稳定后，测量LAD和LCX的多普勒血流速度；行LAD和LCX支配区域的心肌声学造影；
（3）同步记录冠脉灌注压和升主动脉压力（相当Pd/Pa），在未造成桥血管狭窄时，Pd/Pa=1；
（4）通过可调节的缩窄器，使LAD窄后血流量降低90%，15min后静脉持续注入ATL146e，观察Pd/Pa，当Pd/Pa≤0.80，且主动脉压力下降不超过20mmHg为模型成功建立；
  （5）测量LAD和LCX的多普勒血流速度；行LAD和LCX支配区域心肌声学造影；
（6）冠脉狭窄加曲美他嗪组在实施LAD缩窄模型以前2周即开始给予常规治疗曲美他嗪口服（按0.3mg/Kg的剂量添加到食物中, 每日3次），在LAD严重狭窄模型建立后即刻再给予0.6mg/Kg的剂量顿服。冠脉狭窄加安慰剂组给予同等剂量的安慰剂药物口服。
（7）于5min、15min、30min、60min 4个时间点行LAD和LCX区MCE；在各个时间点完成MCE后注入ATL146e并记录LAD的Pd/Pa，和LAD、LCX的冠脉多普勒血流速度；
（7）完成以上步骤后，3组均注入99mTc和131I标记的放射微球。结扎犬的LAD，行MCE确定LAD和LCX的支配区域。从左房注入0.5% Evans蓝溶液，确定心肌危险区。处死动物，取相应的心肌标本行LAD及LCX供区心肌血流量测定；
（8）资料分析：比较3组 之间的MCE测值、Pd/Pa、多普勒血流速度、放射微球心肌灌注、微循环阻力、心电图改变等指标。
2.3 可行性分析
（1）立项依据充分：本研究的切入点是针对急性冠脉狭窄后的心肌保护，是一个非常重要但尚未被充分重视和解决的研究领域。曲美他嗪通过增加葡萄糖氧化,改善糖酵解与糖氧化耦联,优化心肌细胞能量代谢，尤其是对缺血心肌的作用明显，具有良好的治疗心绞痛的前景。
（2）相关实验技术成熟，实验结果可信。本课题组1990年以来从事声学造影剂的制备研究，掌握系统的MCE成像和分析的方法，以及应用MCE进行大量基础和应用研究的能力。本实验室与日本国立循环中心心血管内科、大阪大学廖禹林教授建立了合作关系，实验中使用的犬前降支血流限制性狭窄人工旁路模型是其指导下设计而成，该模型使冠脉狭窄的程度稳定，测得的数据重复性好，结果可靠。
（3）人员配备合理，具有扎实的相关工作基础和完善的实验设备及技术支持。本课题组长期从事冠心病和心肌微循环领域的研究，承担了多项国家自然基金课题，有扎实的工作基础；本实验室具有良好的动物实验条件和完善的动物实验室设备；有一支熟练的从事动物实验的科技队伍。
2.4 统计学分析
计量资料用均数±标准差(μ ±s)表示，对照组和治疗组的对比采用两独立样本t检验。所有统计处理均采用SPSS13.0软件完成，P<0.05视为显著性差异。
3. 研究计划及预期研究成果。
时间（年、月） 研究内容 考核指标
2014. 4－ 2014. 6 优化实验条件，购置相关试剂 导管压力测定、MCE
参数
2014. 7－ 2014. 12 探讨单支冠脉狭窄后血流储备和心肌灌注的变化；明确曲美他嗪对其的影响； FFR ( Pd/Pa)
A、β、A×β值
2015. 1－ 2015. 9 通过组织病理学、炎症反应、氧化应激、心肌细胞凋亡等多个方面阐明曲美他嗪改善缺血心肌血流储备的相关可能机制； FFR ( Pd/Pa)
A、β、A×β值
2015. 10－ 2016. 2 统计数据，分析图像和结果，开始撰写论文； 实验数据
2016. 3－ 2016. 4 查缺补漏，补充实验，继续撰写论文； 论文撰写
预期研究成果
（1）证明盐酸曲美他嗪能有效地保护急性严重冠脉狭窄后的心肌；
（2）初步阐明急性冠脉狭窄后的冠脉循环调节机制以及盐酸曲美他嗪对其影响，为其在改善缺血心肌的疗效应用提供实验依据；
（3）撰写论文1-2篇。
四、研究基础
（申请者与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩，申请者已具备的实验条件、尚缺少的实验条件和拟解决的途径）
（1）项目组多个成员博士研究生期间进行了多项犬心肌声学造影、VVI技术诊断心肌缺血事件等动物实验，掌握系统的MCE成像和分析的方法。课题组实验室的技师有熟练具有从事动物心脏介入手术的基础，能顺利制备犬的急性冠脉闭塞---再通模型、进行FFR测定等。
（2）本实验室有一支熟练的从事大动物实验的科技队伍，能利用冠脉定量缩窄器和多普勒血流计进行标准化控制，能制备出稳定的、重复性高的犬冠脉狭窄模型。本课题组成员就读于南方医院研究生期间，学会犬的LAD穿刺压力监测模型（见下图），为冠脉微循环阻力的计算奠定了扎实的基础。
 （3）项目负责单位暨南大学附属第一医院心内科是博士学位授权点，博士后科研流动站，科室有着浓厚的科研学术氛围，最近3年均获得国家自然基金、教育部高校博士点科研基金、广东省自然科学基金的资助。下属的实验室具有先进的超声影像系统包括Philips IE33、Sequoia 512等，有良好的开展动物实验条件、实验设施齐全。同时有暨南大学动物中心为依托，有多名经验丰富的实验技师，具备了完成课题的相关物质基础。