曲美他嗪对高血压诱导房颤的作用研究
摘要
心房颤动是高血压病常见的并发症，严重影响了高血压病患者的生活质量和寿命，对高血压伴心房颤动的临床和基础研究进行了大量的研究，但仍未完全阐明。近年的研究表明，高血压心肌存在能量代谢失衡，能量代谢障碍贯穿了心肌细胞病理生理变化的过程，纠正心肌能量代谢异常，有可能延缓房颤的发生。本研究项目拟采用体外高压装置按时间和压力梯度处理心房细胞，并结合高血压动物模型和临床观察，检测细胞和组织中相关因子与离子流/编码基因、纤维化指标的变化，并给予曲美他嗪处理验证逆转情况。本研究完成后将明确曲美他嗪对高血压伴房颤的预防和治疗效果。
国内外研究现状
心房颤动(Atrial Fibrillation, AF)是最常见的心律失常之一，是中风，心衰和死亡的主要危险因素。大量证据证实AF与心房的结构和功能重塑过程相关。然而，对于易导致心房重塑过程，促使AF发生的机制研究甚少。临床上可诱发AF的病理因素，如高血压，心力衰竭和二尖瓣病变，其主要的病理特点均为左心房压力增加，导致心房肌细胞受到牵拉，从而激活一系列的信号传导途径，心房肌细胞发生肥厚和电生理改变，促使AF的发生和维持。
一、高血压与AF
高血压与AF的关系尤为密切，一半以上的AF患者合并高血压，而高血压患者的AF发生率是一般人群的近2倍。高血压可引起左室肥厚、僵硬，心室厚度每增加4mm，发生AF的危险就会增加1.3倍。高血压是AF潜在的可调节危险因素，药物治疗控制血压，可以减少AF的发生，但是压力负荷对心房的直接作用仍知之甚少。已有的研究表明，体内的心血管系统承受着三种不同的力学刺激：剪切应力，牵张力和静水压。剪切应力（Shear Stress）是血流对细胞表面产生的摩擦力[1]。牵张力（Cyclic Stretch）是搏动血流致使血管扩张和回缩而产生的力。一般认为生理范围牵张力所致的血管扩张幅度在24%以内[2]。静水压（Hydrostatic Pressure）是指血流对单位面积血管壁的侧压力（即血压）。正常人主动脉内压力达120mmHg，高血压时血管壁静水压明显增加[3]。高血压病人左心房压力增加，机械应力变化主要表现为静水压和牵张力增加。高血压与心房壁紧张度增加相关，导致单个心房肌细胞的拉伸和压力增加，是重塑过程的主要刺激因素。
二、压力负荷诱导心房重构的相关机制
现有的关于高血压在AF发病机制中的研究主要集中在高血压动物模型中，如在慢性高血压（产前暴露于糖皮质激素）羊模型中观察到，高血压组动物心房出现广泛传导异常，心房波长缩短和AF增加。心房肌细胞肥厚和肌溶解，以及疤痕形成。线粒体和核增大，胶原纤维增加，心肌细胞凋亡增加[4]。单肾切除对侧肾动脉绑扎建立左室肥厚（Left Ventricular Hypertrophy，LVH）模型，LVH可使兔左房心房肌细胞晚钠电流升高，从而使其易于发生早后除极(Early Afterdepolarizations，EADs）和自律性增高[5]。Choisy 等观察了自发性高血压大鼠在第3和11个月时电生理重塑和房性心律失常的易感性。3个月大高血压大鼠心房肌细胞的ICa,L降低，至11个月大时心律失常诱导性明显升高[6]。另一个研究在一肾一夹的高血压绵羊模型中观察心房电重塑和结构重塑。7周高血压绵羊，心房发生明显肥厚和间质纤维化。心房有效不应期(Effective Refractory Period，ERP）升高，传导速率（Conduction Velocity，CV）下降和异质性增加，AF可诱导性增加[7]。
高血压的动物模型已证实可引起结构和电重塑，从而增加房性心律失常的易感性。然而，其细胞机制仍未得到很好的阐明。
目前已有的机械力学在AF发病的细胞机制方面的研究，大多集中于牵张力对心房肌细胞结构重塑和电重塑的影响上。如机械牵张单层心房肌细胞，可使肌浆网钙离子三磷酸腺苷酶的表达降低和复极交替性增加，从而使AF易于发生。Saygili E等将心房肌细胞暴露于静止的牵张力，发现牵张力可通过上调基质金属蛋白酶（Matrix Metalloproteinases-2/-9，MMP-2/-9）使其细胞外基质重塑激活，其机制是通过膜上的血管紧张素II（Angiotensin II，Ang II）的I型受体介导的钙神经素（calcineurin，Cn）-活化T细胞核因子（Nuclear Factor of Activated T cells，NFAT ）途径，导致心肌细胞肥大[8]。此外牵张力还可使IK1和IKur的基因表达明显升高。IK1和IKur电流密度明显升高，而Ito密度明显降低，从而导致动作电位时程(Action Potential Duration，APD)明显缩短。洛沙坦可减轻牵张诱导的心房肌细胞肥厚和IK1, IKur和 Ito电流和基因表达改变，预防牵张所致的APD缩短[9]。
  心脏压力超负荷可导致一系列复杂的级联信号瀑布激活，产生适应性应答以维持正常心脏输出。这种适应包括心肌细胞质量、基因表达和代谢的调整。在结构水平，表现为心脏肥大；在转录水平，表现为胚胎期基因再表达，而多种成人期基因表达下调；在代谢水平，表现为心肌能量底物由以脂肪酸β 氧化为主转变为以葡萄糖酵解为主，这与过氧化物酶体增殖
物激活受体α（PPARα）、 中链脂酰辅酶A 脱氢酶(MCAD)、 肌型肉碱棕榈酰转移酶-1(MCPT-1) 活性降低密切相关[10]。
三、曲美他嗪与压力负荷诱导的房颤
正常心肌的能量(ATP)供给60%～70%来自游离脂肪酸β氧化，20%～25%为葡萄糖氧化，5%～10%为糖酵解。游离脂肪酸氧化产生等量ATP的耗氧量比葡萄糖氧化的耗氧量高，而且过高的游离脂肪酸氧化可明显抑制葡萄糖氧化的速率。高血压性心肌肥厚由于毛细血管密度降低、微循环阻力增加，以及神经体液的激活，致使肥厚心肌的血流储备下降[11]。Purushothaman等通过能自发性高血压大鼠（SHR）的序列观察，发现SHR大鼠生后1月出现心肌氧化应激增强，2月出现心肌肥厚，4月出现代谢模式转换（主要表现为脂肪酸氧化减少），表明肥厚的心肌可能代偿性地发生代谢模式改变，减少脂肪酸氧化[12]。这也提示减少脂肪酸氧化可能有助于改善心肌肥厚。因此，优化心肌能量代谢，成为有吸引力的改善心肌缺血，并抑制高血压导致的心肌负性重构以及心衰发生发展的治疗手段。
曲美他嗪（TMZ）是一个新型的抗心绞痛药物，已被美国食品与药品管理局批准用于心绞痛的治疗。主要通过抑制长链3-酮酰辅酶A硫解酶抑制脂肪酸氧化，并刺激丙酮酸脱氢酶，间接使葡萄糖氧化得到加强[13]。因此，在冠状动脉病变而心肌供氧受到限制时，提高氧的利用度，产生更多的高能磷酸键，以缓解心肌缺血症状，并维持心肌的存活和功能。
雷诺嗪与曲美他嗪为同类药物，雷诺嗪 （ranolazine）实验和临床研究还发现有抗心律失常的作用，不仅抑制与心肌缺血、急性冠脉综合征、再灌注损伤、长QT综合症及心力衰竭相关的室性心律失常，也可有效地抑制房性心动过速和心房颤动等房性心律失常。雷诺嗪是一个多离子通道抑制剂，对钠、钾、钙离子电流都有影响，雷诺嗪治疗心绞痛的机制，除了与能量代谢有关外，还可以抑制心肌细胞动作电位中的晚期钠离子流有关，心肌缺血导致缺氧、酸中毒，使晚钠电流增大、细胞内钠离子增多，导致钠钙反向交换，细胞内钙离子蓄积，心肌细胞钙离子超荷可使心肌收缩做功增加，使心肌耗氧增加。
而曲美他嗪治疗房颤的作用和机制仍不清楚，相关的临床及基础研究更少。我们推测，曲美他嗪也有直接的离子通道阻断作用，拟进一步深入探讨。本研究拟在自发的高血压大鼠模型，以及培养HL-1心肌细胞株上探讨曲美他嗪的抗压力负荷诱发房颤以及其参与机制。同时，进行初步的临床观察研究，观察曲美他嗪对高血压患者伴房颤的影响。本研究将为高血压合并房颤的防治提供新的方向和靶点。
3. 参考文献 
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三、研究目标与研究内容
1. 研究目标
（1） 曲美他嗪（TMZ）对压力负荷诱导房颤的作用及机制。
（2） 探讨曲美他嗪对高血压伴房颤的治疗效果。
2. 研究内容
（1） 自发性高血压大鼠模型中，观察与WKY大鼠相比，心脏结构和功能，左房压，离体心脏电生理改变，以及AF的可诱发性。观察左心房肌细胞肥大和间质纤维化与炎症因子，以及与FAK-Src激酶途径激活的相关性；同时观察新鲜分离心房肌细胞电生理特性的改变。并给予曲美他嗪观察对上述改变的逆转情况。
（2） 在培养的HL-1心肌细胞上，观察压力负荷培养条件下，分析不同压力梯度下，观察对高压所致心房肌细胞肥厚和离子通道的影响。分别给予曲美他嗪，观察对压力激活的FAK，Src激酶表达的影响，以及对心房肌细胞结构重塑和电重塑的逆转作用，以期分析心房肌细胞压力调控的机制与实现途径。
（3） 临床研究部分，观察在常规治疗的基础上，加用TMZ治疗对高血压患者心律失常、舒张及收缩功能的影响。选择高血压病患者，在常规治疗的基础上，加用曲美他嗪治疗，并与安慰剂对照，观察心律失常及心功能变化。
四、研究方案（包括研究对象、研究方法、技术路线、统计方法等）
1. HL-1细胞的培养
小鼠的心房肌细胞株（HL-1细胞），获赠自Dr. William Claycomb (Louisiana State University Health Science Center, New Orleans, LA)，培养于加入10%胎牛血清(JRH Biosciences, KS), 2 mM L-谷氨酸，100 μM 去甲肾上腺素，100 U/ml 青霉素和100 μg/ml 链霉素的Claycomb培养基)中。培养瓶预先使用纤连蛋白和明胶处理，细胞培养于37 °C, 5% CO2/95%空气中。培养液每24-48h更换。
2. 实验动物
SHR和WKY大鼠，体重230～280 g，雄性，清洁级，可购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
3. 在体电生理实验
动物吸入异氟醚麻醉。颈内静脉穿刺置管，一根1.1F十级的电生理导管(Scisence Inc.)，置于右心室。食道置入一根4F 十级电生理导管(St. Jude Medical)，靠近左心房，不同对电极进行起搏，可通过体表ECG定位电极位置。心房起搏，强度为2倍舒张阈值，2ms脉宽。S1-S2方案测定ERP，10个S1刺激，基础周长为100ms，跟着单个S2的额外刺激。S1-S2间期递减2ms，直至S2刺激不能传导。ERP定义为能产生夺获的最短S1-S2周期。每个心房进行两次检测，取平均ERP。
4. 电生理参数和心律失常的诱发
使用双极电极起搏离体灌注的心脏左心耳(Left atrial appendage，LAA)和右心耳(Right atrial appendage，RAA)，检测CVs和APD。检测CVs时，周长为100ms，刺激强度为2倍舒张期阈值，脉宽为4ms。信号平均以改善记录的信号-噪声比。计算平均CVs。CV是测量所有传导矢量幅度的平均值。APD的测定，S1-S2刺激，10个S1，周长为100ms，然后一个S2额外刺激，周长为25和100ms。记录复极50% (APD50), 70% (APD70), 90% (APD90)APD。心房ERP和心律失常的诱发通过LAA和RAA的程序性刺激来评估，10个S1刺激，间期为100ms，然后1个额外刺激S2。如心律失常发作持续超过1s，此心脏被认为是可诱发的。
5. 全细胞膜片钳技术记录动作电位和电流
细胞接种于35mm培养皿中，实验干预后弃去培养基，予0.05% 胰蛋白酶–EDTA消化约2min，终止消化，细胞在6h内用于电生理实验。玻璃电极由硼硅玻璃毛细管(Corning 7740, 1.2 mm OD)拉制而成。充满细胞内液后电极尖端电阻为2-3 ΩM 。在液接电位补偿后用负压使电极与细胞表面形成高阻封接后(阻抗?1G?)，在接触细胞前，补偿尖端电位。给负压破膜，形成全细胞记录。Axopatch 200B 放大器，Digidata 1200B-pClamp 7.0 data-acquisition system (Axon Instruments, USA)记录电流信号。5kHz过滤信号，储存于电脑的硬盘中。串联电阻(Rs) 为3-5 MΩ，电补偿70-80%以使在记录电流和钳夹的膜上电压下降时电容激增缩小至最小，并在电流记录过程中保持稳定。实验在25°C 左右进行。
记录动作电位，电极外液 (mmol/l)：NaCl 145; KCl 4; MgCl2 1; CaCl2 1.8; HEPES 10 (pH 7.4)；电极内液 (mmol/l): K-aspartate 120; KCl 25; MgCl2 1; EGTA 10; Na2 phosphocreatine 2; Na2ATP 4; NaGTP 2, HEPES 5 (pH 7.2)。
记录钙电流，电极外液(mmol/l): TEA-Cl 140, CaCl2 5, MgCl2 2, HEPES 10, Glucose 10 (pH 7.4)；电极内液(mmol/l): CsCl 100, TEA-Cl 20, Na2ATP 5, Na2GTP 0.4, EGTA 10, HEPES 10 (pH 7.2)。
记录钾电流，细胞外液(Ito和IK1) (mmol/l) ：140 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 10 HEPES, 2 CaCl2, 10 glucose, 0.5 CdCl2  (1M NaOH将pH 调至7.4)。细胞内液(in mmol/l)：90 potassium aspartate, 20 KCl, 10 HEPES, 1 MgCl2, 5 Na2ATP, and 5 EGTA (2 M KOH将pH调至7.3)。
在形成全细胞状态后，将细胞钳制在-80mV，紧接着施于从-80至+50mV，步阶电压为10mV，波宽为300ms，频率为0.2Hz的刺激，记录ICa,L。以峰电流(pA/pF)对膜电位作图，即得I-V曲线。将I-V曲线的结果转化成膜电导，对条件刺激电压作图，然后采用Boltzmann方程g/gmax=1/{1+exp[(V0.5?V)/S]}进行拟合，式中得到ICa,L激活曲线，然后求得V0.5(半数激活电压)和S (斜率因子)。V0.5 是最大失活电压的半值， V是前置脉冲电位，S 是斜率因子。
失活后时间依赖ICa,L的复活使用配对脉冲方案来研究(P1, P2)。P2 (I2) 间的电流相对于P1 (I1) 的电流测定为P1-P2间期的函数。复活的时程适用于指数函数。
记录IK1, 心房肌细胞钳夹在-40mV，紧接着施于从-130至-10mV，步阶电压为10mV，波宽为500ms，频率为1Hz的刺激。记录Ito，钳夹在?80 mV, 给予20ms的前置刺激至-40 mV以灭活钠电流，电压从-20 至+60mV，步阶电压为10 mV，波宽为500ms，频率为1Hz的刺激。IKur以最后500ms的脉冲刺激的电流水平来计算。APs由一个2ms的阈上刺激引出，频率为2Hz。
6. 临床研究部分：入选18-70岁高血压患者100名，排除合并严重心、肺、肾、肝功能不全、脑中风、妊娠等情况者。在常规治疗基础上，随机分为加用TMZ组及安慰剂组，随访2年。于入组时，入后1年、2年进行临床评估、生化检查、心脏超声和心电图检查。
7. 统计学方法：
所有计量资料采用均值加减标准差( )表示，两组间均值比较采用独立样本t/t′检验，自身对照均值比较，采用配对t检验；多组间均值得比较，采用单因素方差分析，组间均值两两比较，采用SNK法（方差齐）或Dunnett T3 法（方差不齐）；不同时间观察结果，采用上述统计方法对同一时间两组或（独立样本t/t′检验）多组间均值（单因素方差分析）比较。上述统计均由SPSS16.0软件进行统计分析。α=0.05。