曲美他嗪影响大鼠自体移植静脉内膜增生和miR-145表达的实验研究
立题依据
　　冠状动脉粥样硬化性心脏病是严重威胁人类健康的疾病之一，冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass graft，CABG)是治疗该病的重要手段。
　　大隐静脉作为第一个用于CABG术的血管材料，因其解剖位置表浅，易于游离，取材方便；且有足够的长度，能够方便地使病变冠状动脉远端的血管与主动脉或其分支连接等优点，至今仍然是最常用的移植血管材料。然而，术后移植静脉进行性的内膜与中膜增厚，以及在此基础上形成的粥样硬化，使移植静脉的术后10年严重再狭窄或闭塞率达到50％,严重影响了CABG的手术效果【1】。因此，防治CABG术后移植静脉狭窄，对提高CABG手术疗效，避免再次血管化治疗，具有重要的临床意义。
 CABG术后的静脉血管再狭窄，是移植静脉通过复杂的分子机制导致血管的肥厚和限制性血管再构，病变由血栓形成期、内膜增生期、粥样硬化期三个相对独立而又相互关联的病理过程构成【2、3】。
　　术后早期由于静脉内皮损伤、基底膜暴露促进血小板黏附、沉积在损伤部位，分泌凝血因子激活凝血酶原，从而促进局部血栓形成。静脉移植后承受较高动脉压力，张力明显增高，静脉过度扩张引起管壁损伤，导致内皮结构和功能的变化；在众多因素参与下，中膜血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)表型发生改变，分泌各种功能蛋白质，通过自分泌及旁分泌途径刺激VSMC大量增殖并穿过血管内弹性层向内膜迁移，同时合成、分泌过量的细胞外基质，引起新内膜形成及管壁增厚。在内膜增生的基础上，移植静脉发生粥样硬化性病变，最终导致晚期血栓闭塞。
　　因此，内膜增生是CABG术后移植静脉病变的重要病理基础，它提供了日后粥样硬化的土壤【4】。抑制内膜增生是防治CABG术后移植静脉病变的重要策略，也是近年来的研究热点。
　　目前，内膜增生的防治方法主要有药物治疗、放射治疗、基因治疗和血管外支架治疗等，其中基因治疗的前景比较看好，但尚处于实验阶段，应用到临床尚需一定时间。现在临床上可行的方法还是药物治疗。文献报道【5】血管紧张素转换酶抑制剂、钙拮抗剂、糖皮质激素、全反式维甲酸、一氧化氮的底物赖氨酸、他汀类药物等对内膜增生有一定疗效，许多新型药物亦在探索之中，但目前临床上尚无广泛接受的药物和治疗方案。
　　曲美他嗪是一种新型的代谢类药物，它通过抑制脂肪酸β氧化的线粒体酶-长链3-酮酰辅酶A-硫解酶（3-KAT），部分抑制游离脂肪酸的摄取及氧化代谢，同时促进葡萄糖氧化，有效地控制游离脂肪酸／葡萄糖氧化的供能平衡，优化心肌能量代谢，使缺血心肌细胞利用有限的氧产生更多三磷酸腺苷(ATP)，维持缺血心肌细胞的能量代谢及收缩功能【6、7】。临床实践表明其在稳定型心绞痛、心肌梗死、心力衰竭、糖尿病合并冠心病以及扩张型心肌病等心血管疾病领域均有独特的疗效【8-13】。
近年，随着基础和临床研究的深入，发现曲美他嗪还具有多种代谢外作用，包括保护线粒体功能，抑制炎症反应，减少氧化应激，改善内皮功能等【14-16】。曲美他嗪可减轻介入导管引起的桡动脉内皮损伤【17、18】。最新研究表明曲美他嗪可抑制大鼠颈动脉球囊损伤后的内膜增生和VSMC的增殖迁移【19】。但曲美他嗪对自体移植静脉内膜增生的影响国内外尚未见报道。
    MicroRNA (miR)的发现是近年基因表达调控领域最令人激动的进展，它是一组长度19-25bp的生物体基因组编码的内源的、非编码、单链小RNA。microRNA在细胞增殖、分化、代谢与死亡中发挥着重要的调节作用。研究表明大鼠颈动脉球囊损伤模型的血管组织中miR-145表达显著下调。用腺病毒介导miR-145过表达则可明显抑制大鼠颈动脉球囊损伤后的血管内膜增生【20】。进一步研究发现miR-145是通过调控VSMC的表型转化来影响内膜增生。
本研究在建立大鼠自体静脉移植模型的基础上，采用病理形态学分析和免疫组织化学染色方法，观察曲美他嗪对大鼠自体移植静脉内膜增生及增生内膜中miR-145表达的影响，探索曲美他嗪抑制内膜增生的分子机制。研究结果将会对曲美他嗪在CABG术后患者的应用提供理论依据。
参考文献
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研究目标与研究内容
研究内容
（二）    研究对象分组
普通级雄性SD大鼠30只，体重200-250 g。共分成3组，对照组，曲美他嗪10mg/kg组，曲美他嗪20mg/kg组，每组10只。对照组服生理盐水，实验组分别于术前7天开始口服曲美他嗪10mg/kg和20mg/kg。
（二）建立大鼠自体静脉移植模型
取大鼠颈外静脉，与颈总动脉行端端吻合，建立与CABG术后移植静脉病理过程相似的动物模型。
（三）组织形态学改变
术后28天处死动物取移植静脉进行病理学研究。切片常规HE染色和弹力纤维染色，在光学显微镜下观察血管管壁厚度、管腔大小、内膜增生及细胞组成情况。测量移植静脉内膜厚度(I)、中膜厚度(M)。
（四）免疫组织化学改变
免疫组织化学方法检测增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）。计算VSMC增殖率。
（五）实时定量PCR（qRT-PCR）检测移植静脉管壁miR145表达
    Trizol法提取出组织总RNA。U6作为内参照。以提取出的组织总RNA为模板，使用miR-145特异性逆转录引物行逆转录反应合成出cDNA。进行PCR扩增和检测，每个样本检测均重复3次取平均值。相对定量采用比较Ct法：△Ct=CtmiR-145－CtU6，△△Ct=△Ct(实验组)－△Ct(对照组)。根据公式可以计算出实验组中miR-145基因表达倍数=2-△△Ct。
研究目标
1、建立大鼠自体静脉移植模型，方便进行CABG术后移植静脉病变防治的研究。
2、观察曲美他嗪对大鼠自体移植静脉内膜增生的作用和剂量效应关系。
3、观察曲美他嗪对大鼠自体移植静脉内膜增生作用与移植静脉管壁miR-145表达的关系，探索曲美他嗪抑制内膜增生的分子机制。
研究方案
研究方案
（一）研究对象
普通级雄性SD大鼠30只，体重200-250 g。
共分成3组，对照组，曲美他嗪10mg/kg组，曲美他嗪20mg/kg组，每组10只。对照组服生理盐水，实验组分别于术前7天开始口服曲美他嗪10mg/kg和20mg/kg每天。
（二）研究方法
1、实验分组
     共分为3组：
A.对照组：共10只，服生理盐水。手术后28天处死。
B.曲美他嗪10mg/kg组：共10只，术前7天开始口服曲美他嗪10mg/kg/天，术后28天处死。
C.曲美他嗪20mg组：共10只，术前7天开始口服曲美他嗪10mg/kg/天，术后28天处死。
2、    大鼠自体静脉移植模型的建立
实验组大鼠给l0%水合氯醛溶液（300 mg／kg）腹腔注射麻醉。肝素按250 U／kg 经尾静脉全身肝素化。仰卧位固定四肢和头部，颈部备皮，常规消毒铺巾，取颈前正中切口，长约2cm。剪开皮肤，逐层分离，显露右颈外静脉，以无损伤技术游离静脉分支，以8-0缝线结扎，取静脉桥长度约0.6 cm，用生理盐水(含肝素5000 U/L，罂粟碱0.6 g/L)冲洗管腔，并置于同样液体中常温保存。游离同侧颈总动脉后，用血管夹阻断游离的颈总动脉近端和远端，切除一段约0.4 cm，在手术显微镜(×10)下，用9-0无损伤线行颈外静脉-颈总动脉端端间断吻合，共8～10针。放开血管夹，确定移植血管通畅和无出血后缝合切口。术后每天2次皮下注射肝素800 U／kg，连续5 天。青霉素按16万U/kg 肌肉注射预防感染，连续3天。
3、标本处理
    术后28天取标本。麻醉方法同上。经原切口于气管食管沟内找到静脉桥，观察移植静脉充盈状况。于近心端吻合口下，远心端吻合口以上保留动脉约2mm，完整取下静脉桥。10%中性甲醛冲洗管腔并固定24小时，常规脱水，石蜡包埋，连续切片，切片厚度5μm。取移植静脉进行病理学研究和miR-145检测。同时取对侧的正常颈静脉作对照。
4、组织形态学改变
切片常规HE染色和弹力纤维染色，在光学显微镜下观察血管管壁厚度、管腔大小、内膜增生及细胞组成情况。测量移植静脉内膜厚度(I)、中膜厚度(M)以及内膜厚度／中膜厚度比值(I／M)。每张切片取6个视野测定，取测定结果平均值。
5、免疫组织化学改变
PCNA是一种细胞核内酸性蛋白质，与细胞的增殖状态显著相关。通过免疫组织化学方法检测PCNA的表达，能较好地反映细胞的增殖活性。每个标本取6个视野，在400倍光镜下分别记数每个视野中PCNA阳性细胞数和总细胞数，取其平均值。根据公式：血管平滑肌细胞(VSMC)增殖率=PCNA阳性着色细胞数／总细胞数。
6、实时定量PCR检测移植静脉管壁miR-145表达
用Trizol法提取组织总RNA。U6作为内参照。按照miR-145检测试剂盒的操作步骤，以提取的组织总RNA为模板，使用miR-145或U6特异性逆转录引物进行逆转录反应合成cDNA。按照试剂说明书用qRT-PCR对目的片段miR-145或内参U6进行扩增和检测，每个样本检测均重复3次，取平均值以减少误差。相对定量采用比较Ct法：△Ct=CtmiR-145－CtU6，△△Ct=△Ct(实验组)－△Ct(对照组)。根据公式可以计算出实验组中miR-145基因相对表达倍数=2-△△Ct。
胡晓鹏