曲美他嗪对高血压性心肌肥厚的作用及其机制
立题依据
1.研究意义：
　　左心室心肌肥厚（left ventricular hypertrophy, LVH）是高血压病最常见的并发症，主要表现为心室壁增厚，心脏重量增加，心肌细胞体积的增大，成纤维细胞增生，间质纤维化，细胞外基质增加，基因表达改变，导致收缩舒张功能失调，能量代谢和电生理特征的异常。LVH还可造成冠脉微循环稀疏，微血管阻力增加，冠脉血流储备下降，心肌细胞凋亡，最终将导致心力衰竭、心律失常，甚至猝死，严重影响了高血压病患者的生活质量和寿命。因此，积极控制心肌肥厚的发展，从而防治心力衰竭的发生发展，一直是临床和基础研究的热点。目前，对心肌肥厚机制的研究已取得了很大的进展，发现了多条参与心肌肥厚发生发展的信号通路，包括Cq蛋白-蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)通路、丝裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路、钙／钙调素依赖性蛋白激酶(calsium／calmodulin dependent protein kinase，caMK)通路、钙调磷酸酶(calcineurin)-活化T淋巴细胞核因子（nuclear factor of activated T cells, NFAT）通路、磷酯酰肌醇3激酶-AKT（phosphatidylinositol 3-kinase, PI-3K-ATK）通路等[1]。通过对这些信号通路的干预，有可能有效控制心肌肥厚的发生发展。目前在临床上广泛使用的作用于Gq蛋白-PKC通路的血管紧张素Ⅱ转换酶抑制（ACEI）类和血管紧张素Ⅱ受体阻断剂（ARB）类药物，能够改善左心室重构，延缓心肌肥厚的发生发展，取得了一定的效果。然而，心肌肥厚和心力衰竭的流行仍远未达到理想的控制，其主要原因可能在于参与心肌肥厚的许多信号通路之间形成一个复杂的调节网络，因此，需要作用于多靶点的药物联合应用，才能够取得理想的防治效果。因而，深入研究开发新的治疗方向及靶点具有重要意义。
心脏持续不停地进行收缩舒张活动，因而是需要持续能量供应的高耗能器官。近年的研究表明，肥厚的心肌存在能量代谢失衡，主要表现为心肌细胞底物利用途径改变、线粒体功能失常、以及高能磷酸盐代谢异常等[2,3]。能量代谢障碍贯穿了心肌从代尝性肥厚到发生功能衰竭的整个过程，但其与LVH之间的因果关系目前还不明确。纠正心肌能量代谢异常，有可能延缓甚至阻止LVH及心衰的发生发展。本研究拟探讨曲美他嗪（Trimetazidine, TMZ）对高血压性心肌肥厚的作用并进一步探讨一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）-一氧化氮（nitric oxide, NO）通路的介导作用。从而为阐明心肌肥厚的机制提供新的见解，为防治高血压性心肌肥厚提供新的方向和理论依据。
2.    研究现状
　　正常心肌的能量(ATP)供给60%～70%来自游离脂肪酸β氧化，20%～25%为葡萄糖氧化，5%～10%为糖酵解。游离脂肪酸氧化产生等量ATP的耗氧量比葡萄糖氧化的耗氧量高，而且过高的游离脂肪酸氧化可明显抑制葡萄糖氧化的速率。心肌缺血时交感神经兴奋，儿茶酚胺水平升高，致使血中游离脂肪酸水平升高，从而导致心肌能源供给中游离脂肪酸氧化增加（可高达80%～90%），葡萄糖氧化减少[2,3]。这种代谢改变致进一步使心肌细胞氧耗增加，并使葡萄糖无氧酵解增加，心肌细胞内H+、Ca2+超载，进而导致心肌细胞损伤、凋亡、纤维化等，心力衰竭进行性恶化[4]。高血压性心肌肥厚由于毛细血管密度降低、微循环阻力增加，以及神经体液的激活，致使肥厚心肌的血流储备下降[1]。Purushothaman等通过能自发性高血压大鼠（SHR）的序列观察，发现SHR大鼠生后1月出现心肌氧化应激增强，2月出现心肌肥厚，4月出现代谢模式转换（主要表现为脂肪酸氧化减少），表明肥厚的心肌可能代偿性地发生代谢模式改变，减少脂肪酸氧化[5]。这也提示减少脂肪酸氧化可能有助于改善心肌肥厚。因此，优化心肌能量代谢，成为有吸引力的改善心肌缺血，并抑制高血压导致的心肌负性重构以及心衰发生发展的治疗手段。
　　曲美他嗪（TMZ）主要通过抑制长链3-酮酰辅酶A硫解酶（long-chain 3-ketoacyl-CoA thiolase，LC 3-KAT）抑制脂肪酸氧化，并刺激丙酮酸脱氢酶，间接使葡萄糖氧化得到加强[3]。因此，在冠状动脉病变而心肌供氧受到限制时，提高氧的利用度，产生更多的高能磷酸键，以缓解心肌缺血症状，并维持心肌的存活和功能。近年来已有大量临床研究证实曲美他嗪用于治疗缺血性心脏病，包括稳定性心绞痛及急性冠状动脉综合征，均取得明显临床获益[6]。在经皮冠状动脉介入术（PCI）或CAGB围术期加用曲美他嗪，可以显著减轻缺血-再灌注损伤及围术期心肌梗塞发生率[7]。葛均波等荟萃分析了16项曲美他嗪治疗慢性心衰的随机对照临床研究，结果显示，在常规治疗的基础上，加用曲美他嗪显著减轻心衰症状，减少住院次数，改善心功能及心脏负性重构，表明曲美他嗪还可使心衰患者获益[8]。基础研究提示，曲美他嗪的心肌保护作用除了与调节心肌能量代谢有关外，还可能有其它机制，如减轻氧化应激、抗炎、改善内皮功能等参与[9]。基于曲美他嗪用于冠心病及心衰治疗的获益，我们推测曲美他可能用于高血压性心肌肥厚的预防及治疗。最近Fang等在肺动脉缩窄致右心室肥厚大鼠，给予TMZ0.7g/L治疗8周，心肌脂肪酸氧化抑制，葡萄糖氧化显著增加，同时与对照组相比，右心室功能明显改善[10]。Liu等在主动脉缩窄（TAC）20周后的大鼠模型上，发现曲美他嗪治疗可以显著改善心肌纤维化及血管周围纤维化，其机制可能与NADPH氧化酶-活性氧（ROS）-结缔组织生长因子（CTGF）通路有关[11]。但曲美他嗪治疗高血压性心肌肥厚最佳治疗时机及机制仍不清楚，相关的临床及基础研究较少。我们推测，曲美他嗪抑制心肌肥厚的效应很可能通过一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）-一氧化氮（nitric oxice, NO）通路介导，拟进一步深入探讨。
　　NO是在血管内皮细胞或心肌细胞内由一氧化氮合酶（NOS）催化L-精氨酸（L-Arg）形成的。NOS具有3种异构体：神经型NOS（nNOS，NOS1）、内皮型NOS（eNOS，NOS3）、诱导型NOS（iNOS，NOS2）。目前已证实，这3种NOS均在心肌细胞表达。nNOS存在于心肌细胞中肌浆网上接近钙离子释放通道处，eNOS存在于心肌细胞接近L型钙离子通道的穴样凹陷处。nNOS和eNOS在生理状态下即可催化NO的基础释放，发挥生物效应，而iNOS在正常条件下无活性表达，当有刺激因子时才迅速表达[12,13]。目前认为， eNOS及nNOS催化产生的NO发挥明显的抗心肌肥大作用，NO被认为是抑制心肌肥大的内源性抑制物。NO通过激活心肌细胞内可溶性的鸟苷酸环化酶（guanylyl cyclase,GC）而刺激cGMP生成，进而激活cGMP依赖蛋白激酶1（PKG1），后者抑制经L型钙离子通道的钙内流而抑制calcineurin-NFAT途径磷酸化而促进抗心肌肥大效应。PKG1的活化也可促进丝裂酶原激活的蛋白激酶磷酸酶-1（MKP-1）的表达，通过使MAPK去磷酸化而抑制心肌肥厚[12,13]。NO还可以通过非cGMP依赖的途径抑制促心肌肥厚的通路[12]。
　　我们既往的研究中，以AICAR或二甲双胍激活AMP依赖的蛋白激酶（AMPK）能够改善TAC大鼠心肌细胞能量代谢，同时显著抑制心肌肥大、间质纤维化，改善心功能。而这种作用部分是经NOS-NO通路介导[14]。Di Napoli等在离体大鼠缺血-再灌注研究中发现，曲美他嗪治疗显著减轻缺血-再灌注损伤，同时eNOS及NO水平升高，而NOS抑制剂L-NAME阻断了这种效应，表明曲美他嗪通过NOS-NO通路发挥心肌保护作用[15]。这也提示，在能量代谢重构与心肌重构之间，NOS-NO可能通过直接或间接的作用介导。因此，我们有理由推测，曲美他嗪有可能可能通过优化心肌能量代谢而抑制高血压性心肌肥厚的发生发展，而NOS-NO通路在其中也起着重要的介导作用。
　　本研究拟在主动脉缩窄（TAC）高血压大鼠模型，以及培养新生大鼠心肌细胞上探讨曲美他嗪的抗心肌肥厚作用并进而阐明NOS-NO通路的参与机制。同时，进行初步的临床观察研究，观察曲美他嗪对高血压患者心肌肥厚及心脏收缩及舒张功能的影响。本研究将对阐明心肌肥厚的机制提供新的见解，为高血压性心肌肥厚的防治提供新的方向和靶点。
3. 参考文献   
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1.研究目标
1)了解曲美他嗪（TMZ）对高血压性心肌肥厚的作用。
2)探讨曲美他嗪抗心肌肥厚的机制，主要阐明NOS-NO通路在曲美他嗪效应机制中的作用。
2.研究内容
（1）临床研究部分：观察在常规治疗的基础上，加用TMZ治疗对高血压患者左心室肥厚、舒张及收缩功能的影响。
（2）在主动脉缩窄（TAC）高血压大鼠，观察TMZ治疗对左心室形态、组织学及功能学的作用，以及NOS-NO通路在TMZ效应机制中的作用。
（3）在培养的新生大鼠心肌细胞上，观察NOS－NO通路在TMZ抑制心肌肥厚的作用及其机制。
研究方案
1.技术路线
（1）在体动物研究部分：
a)建立主动脉缩窄（TAC）高血压心肌肥厚大鼠模型。给心肌肥厚大鼠口服TMZ，观察对心脏肥厚的影响。观察指标：血流动力学、心脏形态学、心肌生化及相关信号分子。
b)给TAC心肌肥厚大鼠服用NOS阻断剂L-NAME或NOS的前体物L-Arg，同时给大鼠口服TMZ，观察对心脏肥厚及相关信号分子的影响。
（2）心肌细胞培养研究部分：
a)在培养的新生大鼠心肌细胞上，用血管紧素Ⅱ刺激诱发心肌细胞肥大。给予TMZ，观察心肌细胞的形态、测定蛋白质合成速率，检测NOS（包括eNOS、nNOS、iNOS）水平及活性、NO的含量、MAPK（包括ERK、JNK、P38MAPK）水平等。
b)在培养的新生大鼠心肌细胞上，用血管紧素Ⅱ刺激诱发心肌细胞肥大。加入NOS阻断剂L-NAME或NOS的前体物L-Arg，观察心肌肥大的变化，探讨NOS－NO系统对TMZ作用的影响。
（3）临床研究部分：
a)选择高血压病患者，在常规治疗的基础上，加用曲美他嗪治疗，并与安慰剂对照，观察心脏肥厚及心功能变化。

2. 具体实验和研究方法：
（1）腹主动脉缩窄的高血压性心肌肥厚大鼠实验模型的建立：8-10周龄SD大鼠，麻醉和无菌技术下，腹正中切口，于右肾动脉上方游离出1cm长的主动脉脉，将其与7号针头同时结扎后，抽出针头，造成主动脉狭窄70-80%。
（2）心肌细胞培养：无菌操作下取出1-3天新生大鼠心脏，去除心胞及心底结缔组织，剪碎，以胶原酶和胰蛋白酶交替消化，据差速贴壁法分离心肌细胞和心肌成纤维细胞，分别培养。
（3）给药方法：在体实验部分，L-NAME、L-Arg、TMZ灌胃给药。细胞培养部分：血管紧张素Ⅱ、L-Arg、L-NAME的最终浓度分别为0.1μM、0.1mM、1mM、1Mm。
（4）血流动力学测定：超声心动图测左心室大小、功能等。动物处死前经颈动脉插管测主动脉压、左心室发展压等。
（5）形态学观察：心脏重量、左心室重量，心脏切片测定左心室室壁厚度，HE染色测心肌细胞大小，Masson’s-Trichrome (MTC)法胶原染色, 测间质纤维化面积。
（6）心肌细胞和心肌成纤维细胞蛋白质合成速率：以[3H]亮氨酸的掺入量表示蛋白质的合成速率。收集细胞于玻璃纤维素膜上，三氯乙酸固定，洗去游离的同位素标记物，烘干后置于含5 ml闪烁液的闪烁瓶中，以液体闪烁仪测定放射强度。
（7）NO的测量：生物系统中NO释放后很快转变为亚硝酸盐和硝酸盐，两者性质稳定，测定亚硝酸盐／硝酸盐含量来间接反映NO的生成量，用比色法试剂盒按操作说明测定。
（8）Western Blotting测定NOS（包括eNOS、nNOS、iNOS）、MAPK（包括ERK、JNK、P38MAPK及相应的磷酸化MAPK）。组织匀浆或细胞裂解，总蛋白定量，以每道20μg总蛋白进行SDS-PAGE分离蛋白质，然后，转至PVDF膜，先后加入各蛋白的特异性抗体，再加入二抗，洗脱后加发光液进行曝光，图像处理软件测定各条带的光密度积分计量。
（9）临床研究部分：入选18-70岁高血压患者200名，排除合并严重心、肺、肾、肝功能不全、脑中风、妊娠等情况者。在常规治疗基础上，随机分为加用TMZ组及安慰剂组，随访2年。于入组时，入后1年、2年进行临床评估、生化检查及心脏超声检查。
张成喜