曲美他嗪对糖尿病心肌病大鼠舒张功能、肌联蛋白titin及AGEs-RAGE的影响
立题依据
1、研究意义
　　心力衰竭（heart failure, HF）为各种心脏病的终末阶段，其发病率高，5年存活率与恶性肿瘤相仿。糖尿病（diabetes mellitus, DM）发生心力衰竭为无糖尿病者的2倍以上。糖尿病还可恶化心衰的预后，显著增加心衰患者的住院率及死亡率，两者并存，预后极差。糖尿病性心肌病早期舒张功能受损，左室室壁被动僵硬度增高是重要病理机制。以往的研究提示心肌肥厚、心肌间质纤维化、糖基化终产物(Advanced glycation end products，AGEs)沉积、心肌细胞被动张力改变均可影响室壁僵硬度。人羧甲基赖氨酸(carboxymethyllysine，CML) 和心肌肌联蛋白(cardiac titin)是影响左室室壁被动僵硬度的两大重要环节。CML是AGEs的主要抗原性物质，可通过与受体RAGE结合导致多条信号通道改变，影响心脏功能。Titin是心肌细胞执行舒张功能的结构基础，是肌小节蛋白水平调整室壁被动张力的主要途径。曲美他嗪可以改善糖尿病合并缺血性心肌病患者的心功能。本研究拟通过糖尿病心肌病模型，观察曲美他嗪对心脏舒张功能不全、titin转录水平和位点甲基化、蛋白表达和N2B/N2BA亚型比例、蛋白磷酸化改变，来探讨曲美他嗪改善糖尿病心肌病左室舒张功能不全的作用机制，为糖尿病心肌病左室舒张功能不全的治疗提供新的途径。
2、国内外研究现状
　　舒张性心力衰竭（diastolic heart failure, DHF）是指在心室收缩功能正常的情况下，心室松弛缓慢和僵硬度增高使心室充盈减少和充盈压升高，从而导致肺循环和体循环淤血的综合征。1998年欧洲舒张性心衰研究组研究认为DHF约占所有心衰病例的三分之一，其自然病程较收缩性心衰（systolic heart failure, SHF）为好，患病率和死亡率也较低[1]。近10年来，国际流行病学研究发现DHF占所有心衰的发生率由38％增至54％[2, 3]，而且，DHF和SHF的再住院率相似，其预后一样严重[4]。而在我国，推算单纯DHF患者至少达400万[5]。因此，积极防治DHF具有重要意义。DHF的发生机制与心室肌被动力学属性改变或/和主动松弛性能降低有关。左心舒张早期是心室肌主动松弛及依赖于收缩的恢复力产生的过程，舒张晚期则以室壁被动充盈为特征。在此期间，心肌肌联蛋白（titin）是重要的参与因素。
    Titin是一个相对较晚发现的肌小节蛋白，主要生物学特性有：分子量巨大，为3000- 3700kDa；在横纹肌中含量丰富，仅次于肌球蛋白和肌动蛋白；形态细长，N-C末端跨越半个肌小节，在松弛状态下总长度约1.85μm。Titin的发现是对滑行肌丝模型理论（sliding filament model）的重要补充。著名的滑行肌丝模型提出肌原纤维中粗肌丝（肌球蛋白肌丝）和细肌丝(肌动蛋白肌丝)有规律排列，肌肉的收缩和舒张是由于这两组肌丝发生相对滑动的结果。但上述模型并不能完整地解释肌肉的舒张活动，如舒张期粗、细肌丝处于解耦联状态时肌小节如何维持结构的完整性，肌小节过度伸长时如何产生弹性张力。Titin作为肌原纤维中的“第三肌丝”，N末端与肌动蛋白相互作用并固定于Z线，C末端附着在M线的肌球蛋白上，其结构特点有利于维持肌原纤维的完整性和稳定性，为粗肌丝装配的模版蛋白[6, 7]。并且，titin的I带部分具有高度折叠的弹簧样分子结构，是心肌细胞执行舒张功能的重要结构基础[8, 9]。I带结构具有双向调节作用：肌小节处于松弛状态时，I带片段呈高度折叠。在舒张期肌小节被动伸长时，I带展开，由此产生被动性张力，影响舒张后期心脏顺应性。在收缩期肌小节受到压缩，I带存储弹性回缩势能，产生恢复力，影响舒张早期心脏抽吸作用。在心肌细胞中同时表达N2B和N2BA两种亚型，N2B更短更僵硬，N2BA更长更有弹性，N2B/N2BA比值的变化可导致心脏僵硬度发生明显的改变[10]。近10年，有关titin的生理功能研究日趋成熟，并成为心脏舒张功能不全机制研究中的一个热点。国外多个实验表明titin是在肌小节蛋白水平调整室壁被动张力的重要途径，各种生理和病理性因素可通过titin对心脏舒张功能起到急性或慢性的调整作用[11]。Wu等予狗行快速起搏4周，测心脏呈舒张功能不全，其发生机制与N2B/N2BA比值上调导致心肌细胞被动张力增高有关[12]。自发性高血压小鼠模型中，亦发现高压力负荷可导致心肌细胞更多的表达N2B亚型，N2BA亚型表达减少，心肌细胞被动张力升高，心脏功能改变[13,14]。对于扩张性心脏病及缺血性心脏病患者的心肌组织检查却发现N2BA比例升高[15, 16]。最近的文献则报道，在糖尿病并左室射血分数正常心衰的患者中发现，心肌细胞张力升高导致左室舒张功能障碍，其作用机制主要与titin亚型的磷酸化程度改变有关[28]。我们既往的研究证实羧甲基赖氨酸和糖基化终产物与糖尿病性心肌病心脏舒张功能不全相关，并伴有肌联蛋白titin转录增强。
　　曲美他嗪可以特异性地抑制长链乙酰辅酶 A 酰基转移酶（3-KAT）的活性，将心肌细胞的供能由脂肪酸氧化（FAO）转变为葡萄糖供能[17]，临床证实对稳定性心绞痛[18]以及慢性心力衰竭[19-21]具有治疗作用。研究表明，曲美他嗪具有抗氧化应激、减少炎症反应[22]的作用，从而对心肌具有保护作用。动物实验表明，曲美他嗪对合并糖尿病的心肌增加GLUT4表达[23]，可减轻糖尿病心肌病心肌纤维化、改善心肌病理损伤及超微结构[24]。然而，其对糖尿病心肌病舒张功能的影响研究尚少，尚未见曲美他嗪对糖尿病心肌病舒张功能、titin蛋白以及AGEs-RAGE影响的研究。本研究拟通过糖尿病心肌病模型，观察曲美他嗪对心脏舒张功能不全、titin蛋白的变化，来探讨曲美他嗪改善糖尿病心肌病左室舒张功能不全的作用机制。
3. 拟解决的关键问题
（1）确定曲美他嗪对糖尿病心肌病大鼠舒张功能不全的改善作用。
（2）明确曲美他嗪改善糖尿病心肌病大鼠舒张功能不全的作用机制。
（3）明确曲美他嗪对糖尿病心肌病大鼠titin蛋白以及AGEs-RAGE的影响。
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研究目标与研究内容
一 研究目标
1.  确定曲美他嗪对糖尿病心肌病大鼠舒张功能不全的影响。
2.探讨曲美他嗪改善糖尿病心肌病大鼠舒张功能不全的作用机制。

二 研究内容
1.观察糖尿病心肌病大鼠舒张功能不全的心脏大体形态改变和心肌组织、细胞显微结构的改变。
2.观察糖尿病心肌病大鼠舒张功能不全的心肌间质纤维化的改变、AGEs-RAGE的变化。定量检测titin在基因转录、蛋白表达及磷酸化方面的改变。
3.观察曲美他嗪对糖尿病心肌病大鼠舒张功能不全的影响（E/A、±dp/dtmax）。
4.观察曲美他嗪糖尿病心肌病大鼠心肌间质纤维和糖基化终产物及其受体系统（AGEs-RAGE）的影响。
5.观察曲美他嗪对糖尿病心肌病大鼠肌联蛋白titin在基因转录、蛋白表达及磷酸化方面的改变。
研究方案
一、研究对象：
糖尿病心肌病大鼠模型。
二、研究方法：
1.    建立糖尿病心肌病大鼠模型：清洁级雄性4周龄Wistar大鼠，购自中山大学动物实验中心，体重140~150g，5~6周龄，饲养于标准环境，自由进食，12小时光照周期。随机数字表选取10只作为正常组饲以常规的啮齿类动物饲料。其余40只始终饲以高糖高脂饲料（基础饲料 60%，熟猪油15%，糖2%，全脂奶粉8%，鸡蛋黄粉 8%，酪蛋白4%，食盐1%）。4周后，使用单次腹腔内注射链脲菌素（STZ）70mg/kg诱导糖尿病大鼠模型。72h内随机血糖≥16.7mmol/L为成功模型。对照组仅腹腔内注射等量的枸橼酸缓冲液。观察大鼠一般状况，记录体重、饮水等状况。
2.    实验分组：40只糖尿病心肌病大鼠模型用查表法随机分成4组，对照组（n=10）、他汀组（阿托伐他汀10 mg﹒kg-1﹒d-1）（n=10）、低剂量曲美他嗪组（15mg﹒kg-1﹒d-1）（n=10）、高剂量曲美他嗪组（30mg﹒kg-1﹒d-1）（n=10）四组，干预16周。
3.到达实验时间行下述活体检查：
（1）一般特性检查：体重，抽血测血糖值、总胆固醇、甘油三脂、HDL-C、LDL-C、胰岛素值、糖化血红蛋白、BNP。胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)公式计算，即HOMA-IR=空腹血糖(FBS)(mmol／L)×空腹胰岛素(FINS)(μU／m1)／22.5。
（2）左室导管检测：行心脏多普勒超声检测后1小时内行左室导管检测。静注麻醉后切开气管，插入气管插管接呼吸机。分离左颈总动脉，逆行插入导管，于主动脉处停留，将导管连接生理记录仪，待稳定5分钟后测量主动脉收缩压(SBP)和舒张压(DBP)。继续将导管逆行插入至左心室腔内，待稳定15分钟后描记左室内容量-压力曲线。测量左室收缩压(LVSP)和舒张末压(LVEDP)、左室压力最大上升和下降速率(±dp/dtmax)，计算左室松弛时间常数和室壁张力指数。
4.离体心脏检测：
（1）心脏秤重，计算重量指数。
（2）病理染色：常规HE染色，定量测量心肌直径大小。Masson染色，定量测量胶原容积分数。电镜检查检测心肌细胞显微结构改变。
（3）Titin检测，分别进行mRNA定量和蛋白定量：real time PCR定量测定总titin、N2AB和N2B mRNA数量，检测亚型相关位点是否存在甲基化改变；Western免疫印迹方法测定总titin、N2AB和N2B的蛋白量，计算N2BA/N2B比值；SDS-PAGE电泳后先后使用荧光染料Pro Q和SYPRO Ruby染色，扫描定量测量N2AB/N2B和磷酸化N2AB/N2B的荧光强度。
（4）心肌间质纤维化测定：使用免疫组化方法，定量测定左室壁心肌间质Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维；测量不可溶性羟脯氨酸定量，评价间质胶原纤维可溶性性质的改变。
（5）AGEs-RAGE系统的评估：使用免疫组化方法定量测定CML-AGEs在心肌组织中的沉积；real time PCR定量测定RAGE的转录水平，Western免疫印迹方法测定RAGE的蛋白量。
5.统计学分析
　　用SPSS11.0统计软件包进行数据处理，均数以x±s表示。两个样本均数比较采用Independent-Sample T test 进行检验；多个样本比较采用One-way ANOVA分析；多个样本均数两两比较采用LSD法。P < 0.05表示差异有显著性意义。
刘金来