急性房颤心房电重构的能量代谢变化及曲美他嗪干预研究
立题依据
1．国内外发展研究现状
　　心房颤动(atrial fibrillation，AF)是常见的心律失常，人群中总发病率达1%，且随年龄增加发病率增高，65岁以上者达5%，超过75岁者达10%，器质性心脏病达40%，具有较高致残、致死率。然而，目前尚无一种较为满意的治疗方法，这就促进了对其发生机制的研究。1995年Wijffels等[1]首次提出了心房电重构的概念，即房颤能缩短心房有效不应期（AERP），而心房有效不应期的缩短可导致房颤的发作频率增加，发作持续时间延长，即使没有器质性病变者，仅电重构也能使房颤发作并持续。对AF或快速心房起搏引起的心房电重构有较多的研究资料。Morillo等[2]通过动物实验发现，以400次/分的频率起搏心房能引起持续AF，且AF引起的快速心房激动是AF引起心房电重构的基础。随后许多学者通过快速起搏心房的方法建立实验模型来研究快速起搏所导致的心房电生理的变化，即心房电重构的特点。部分研究证实[3、4]，AF能降低心房的有效不应期，AF发生数分钟AERP就会降低，但AERP的降低需持续数天至数周才恢复正常。我们的前期研究获得了同样的结论[5、6]。
　　“房颤引起房颤(atrial fibrillation begets atrial fibrillation)” 已得到广泛认同。其主要原因是心房在房颤发生时出现心房不应期缩短，离散度增加。Yue等[7]通过动物实验显示，快速心房起搏后犬心房肌细胞L型钙通道α1c亚基的mRNA水平量减少。Lai等[8]研究房颤病人的心房肌细胞，除了有L型钙通道α1c基的mRNA水平降低外，编码肌浆网Ca2+-ATP酶mRNA水平降低。这些改变导致细胞内Ca2+浓度升高，且在心房肌细胞间表现不均一。细胞内Ca2+增加可引起K+通道的激活，导致心房肌不应期缩短，离散度增加。细胞内Ca2+超载是发生心房电重构的重要机制。
　　心肌能量代谢异常，使细胞内K+和Mg2+浓度下降，Na+和Ca2+浓度升高，0相上升速度和幅度降低，电传导减慢，导致传导阻滞。当相邻心肌组织传导不一致时，可能导致折返心律失常；Ca2+流动异常，快反应细胞可表现出慢反应细胞特性，出现异常自律性；离子细胞膜内外的振荡，诱发触发活动，可引起快速型心律失常的发生。心肌能量代谢异常，还可导致心肌间连接异常，也是致心律失常的原因；部分心律失常也可引起心肌细胞代谢异常，从而又加重心律失常。总之，心肌细胞能量代谢异常可导致各种类型的心律失常。
　　曲美他嗪为一种3-酮脂酰辅酶A转硫酶抑制药，直接抑制线粒体上脂肪酸氧化过程，是一种代谢类抗心肌缺血药物，广泛应用于治疗冠心病、心肌病和心力衰竭。近年来一些研究表明， 曲美他嗪可能具有一定的抗心律失常作用。HAN等[9]的研究证实， 曲美他嗪可显著提高心房组织中一氧化氮合酶活性，改善心房组织代谢，并推测该作用可能抑制房颤的心房重构过程。曲美他嗪作为作用于代谢途径的一种新型抗心肌缺血药。大量基础研究证实，曲美他嗪能减少细胞内H+、Na+、Ca2+超载，抑制氧自由基生成，稳定线粒体膜功能状态，具有抗氧化、抗凋亡、保护细胞收缩功能等多种细胞保护作用[10]。我们推测快速心房颤动可致心房肌缺血，可能会打破心房肌能量代谢平衡，从而加重电重构现象，更易诱发房颤，并使之维持。曲美他嗪具有优化能量代谢作用，然而曲美他嗪是否具有能够预防或逆转心房电重构的作用，目前国内外尚无相关报道。
2.本项目的研究意义
　　大量研究证据提示心房电重构在房颤的发生和维持中起着重要作用。Ca2+超载是心房重构的重要机制，但快速房颤心房电重构时，心房肌细胞能量代谢究竟发生了何种变化，优化能量代谢水平是否对细胞内Ca2+浓度产生影响，以及是否会对心房电重构产生影响，目前人们对能量代谢治疗在心房电重构中的作用却知之甚少。
因此本研究首先在整体水平建立房颤心房重构的动物模型，并复制房颤时心房电重构现象，观察房颤发生心房电重构时心肌细胞的能量代谢变化，并研究应用曲美他嗪干预能量代谢对心房电重构的影响。以期阐明心房颤动时心肌能量代谢变化的特点，以及优化能量代谢治疗对房颤电重构的影响。从而为遏制房颤心房重构发生发展提供理论基础，为房颤的现代化治疗提供新的治疗思路。
3.拟解决的关键问题
理论关键：
（1）心房颤动的心房电重构时心房肌细胞能量代谢发生何种变化？心房肌细胞能量代谢变化是否参与了细胞内Ca2+超载?
（2）优化能量代谢治疗是否影响细胞内Ca2+超载? 曲美他嗪是否具有能够预防或逆转心房电重构的作用？
以上问题的阐明，将为心脏能量代谢药物曲美他嗪的临床应用提供新的治疗靶点，为防治心房颤动心房电重构开拓全新的治疗思路。
技术关键：
（1）成功建立心房颤动心房重构的动物模型，准确复制出心房电重构重构现象。
（2）应用色谱分析法测定心肌组织磷酸肌酸(CrP)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)含量。
（3）应用共聚焦显微镜精确检测心房肌细胞内Ca2+浓度变化。
4. 主要参考文献目录
[1] Wijffels MC，Kirchhof  CJ .Dorland R.et al.Atrial fibrillation begets atrial fibrillation:a study in awake chronically instrumented goats[J].Circulation，1995，92（5）:1954.
[2] Morillo CA，Klein GJ，Jones DL，et al.Chronic rapid pacing:structural，functional and electrophysiological characteristics of new model of sustained atrial fibrillation[J].Circulation，1995，91:1588
[3] Elvan A，Wylie K，Zipes DP.Pacing-induced chronic atrial fibrillation impairs sinus node function in dogs:electrophysiological remodeling[J].Circulation，1996，94:2953-2960
[4] Gaspo R，Bosch RF，Talajic M，et al.Functional mechanisms underlying tachycardia-induced sustained atrial fibrillation in a chronic dog model[J].Circulation，1997，96:4027-4035
[5] 魏立业， 夏岳， 戚国庆， 杨志瑜. 应用BL-420生物机能实验系统制作急性心房颤动动物模型[J]. 中国心血管杂志，2009，14（1）：41-42.
[6] 魏立业，夏岳，戚国庆，李永星. 氯沙坦对家兔快速心房起搏心房电重构及L-型钙通道的影响[J].  临床心血管病杂志，2009，25（1）：49-51.
[7] Yue LX，Melnyk P，Gaspo R，et al.Molecular mechanisms underlying  ionic remodeling in a dog model of atrial fibrillation[J].Circ Res，1999，84:776
[8] Lai LP，Su MJ，Lin JL，et al.Down regulation of L-type calcium  channel and sarcopasmic reticular Ca2+-ATPase mRNA in human atrial fibrillation without significant change in the mRNA of ryanodine  receptor，calsequestrin and phospholamban-an insight into the  mechanism of atrial remodeling.JAAC，1999，33:1231-1237
[9] HAN W，LI W M，ZHOU H Y，et al． Effects of trimetazidine on atrial structural remodeling and platelet activation in dogs with atrial fibrillation［J］．Chin Med J，2009， 122 ( 18) : 2180－2183．
[10] 夏铭蔚， 马礼坤. 曲美他嗪在心血管疾病中的临床应用进展[J]. 医学综述， 2008， 14( 14) : 2186 -2188 .
研究目标与研究内容
1. 研究目标
　　本研究通过建立心房颤动心房电重构的动物模型，从代谢水平研究在快速起搏心房肌致房颤电重构过程中的能量代谢变化，并进一步探讨优化能量代谢治疗对快速房颤心房电重构的作用，并应用共聚焦显微镜检测心房肌细胞内Ca2+浓度变化，进一步阐明曲美他嗪干预心房电重构的分子机制，为能量代谢药物曲美他嗪的临床应用开发新的适应症，为防治心房颤动心房电重构提供新的治疗靶点。
2. 研究内容
（1）在整体水平上制备心房颤动动物模型观察心房重构现象。
     选取健康新西兰兔，应用BL-420生物机能实验系统电刺激仪以600次/min的频率起搏右心房，制备心房颤动家兔动物模型。研究心房电重构现象。观察指标：心房有效不应期的变化。
（2）测定快速房颤时心房肌组织磷酸肌酸(CrP)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)含量以及Ca2+浓度的变化，并观察曲美他嗪的干预效果。
成功制备心房颤动动物模型后，采用2.5%戊巴比妥钠耳缘静脉注射麻醉动物，待麻醉成功后，开胸取右心房心肌组。应用色谱分析法测定心肌组织磷酸肌酸(CrP)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)含量。应用共聚焦显微镜精确检测心房肌细胞内Ca2+浓度变化。
研究方案
研究对象与方法：
（1）实验动物分组
     选取健康普通足龄新西兰家兔60只，雌雄不限。分别测量体重（BM）、心率(HR)后，随机分为2组(每组30只)：对照组、试验组；实验组给予曲美他嗪5mg/Kg/d，灌胃1周，对照组给予同等剂量安慰剂，建立房颤动物模型。
（2）房颤模型建立及心房有效不应期测定
     应用3%戊巴比妥钠按30mg/kg经兔耳缘静脉注射麻醉后，将兔仰卧固定于兔台，记录体表心电图，颈部正中切口，行气管插管，分离右侧颈内静脉，切开置入2根4F双极电极导管至右心房，应用BL-420生物机能实验系统电刺激仪，首先测心房起搏阈值，以起搏阈值的2倍为输出电压，测定基础状态下心房有效不应期（AERP），S1、S2程控刺激，S1、S2间期从250ms开始递减扫描，步长为10ms，到不应期后再延长10ms，2ms递减，重复测定3次，取其均值记录AERP。继而以600次/min的频率起搏，脉宽0.1ms，并分别于起搏后0.5、1、2、4、6、8小时及停止起搏后10、20、30分钟重复测定AERP。【参见我们发表的论文: 应用BL-420生物机能实验系统制作急性心房颤动动物模型 中国心血管杂志，2009，14（1）：41-42.】
（3）应用色谱分析法测定心肌组织磷酸肌酸(CrP)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)和一磷酸腺苷(AMP)含量。 
取0.1g液氮冻存心房肌组织，加入0．42mol／L高氯酸1ml，匀浆，在4℃以3500 r／min离心10 min，取上清加入1 mol/L氢氧化钾，调整体系pH值在6.0-6.5之间，于冰上放置5min。4℃、12 000 r／min离心10 min，取上清液20μl用LC-235高效液相色谱仪(美国PE公司产品)测定CrP、ATP、ADP和AMP含量，计算总腺苷酸池(TAN=ATP+ADP+AMP)。
（4）激光扫描共聚焦显微镜检测心房肌细胞游离钙浓度
　　采用膜通透性Ca2+敏感染料Fluo-3 AM作为检测心肌细胞游离钙的荧光探针，心肌细胞首先用5-10μM Fluo-3 AM(先用二甲基亚砜溶解后，再溶于正常台氏液)室温下孵育30 min。正常台氏液含有(mM )：137 NaCl, 5.4 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, and 10 glucose, pH 7.4 (用NaOH调节)。然后，心肌细胞用台氏液彻底冲洗，以便移除细胞外Fluo-3 AM，并置于细胞池静止15–30 min，使染料脱脂。最后用Zeiss LSM-510倒置激光显微镜采集激光图像。用488 nm氩激光激发，用505 nm测量。用行扫描模式(扫描速度：0.075 μm/像素，512 像素/行，2ms间隔)，在加药前后对同一培养皿内来自不同细胞的图像进行采集。通过声光可调滤波器将激光减弱到最大功率(25 mW)的1%，使漂白作用和激光对细胞的损伤降到最低，所有的实验均在室温下进行。
统计方法：
　　所用数据输入SPSS13.0统计软件包进行统计，符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用重复测量设计方差分析，组间两两比较采用SNK法进行分析。检验水准为α=0.05。
技术路线：
夏岳