曲美他嗪对再灌注心律失常钙超载的影响及作用机制
立题依据
　　随着冠心病治疗的进展，再灌注治疗措施可使阻塞的冠脉再通，但人们发现心肌缺血后尽管血流已恢复，反而出现心肌细胞损伤加重的病理状态，即缺血再灌注损伤（Myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI）引起功能障碍及心律失常。再灌注心律失常（Reperfusion Arrhythmias，RA）是梗死相关血管再通的重要指标之一,也是MIRI中最常见的并发症，可出现短暂的加速室性自主心律,短阵室性心动过速(室速)或心室颤动(室颤),房室或束支传导阻滞突然消失或出现一过性窦性心动过缓、窦房阻滞等,其发生率达50% ～80%。但这些心律失常尤其是室性心律失常常常导致患者的血流动力学改变，是缺血再灌注期患者猝死的原因之一,如不及时处理，可引发严重的后果。另外再灌注性心律失常与AMI早期细胞凋亡有关,进而影响左室功能的恢复,对心梗后心功能的恢复有不利影响。因此，再灌注心律失常的发生机制、临床特点及防治措施的研究已成为心脏病学领域的一个重要研究课题。
　　目前发现再灌注心律失常发生机制主要为钙超载和氧自由基，此外还有其他原因，如心肌细胞内游离脂肪酸增加、血小板激活因子释放增加以及肾上腺浓度升高等[1]。细胞内钙超载是心肌缺血再灌注损伤的特征之一，也可能是心肌RA发生的原因之一[2]。Na+-Ca2+交换可能是缺血再灌注引起的Ca2+超载及心肌细胞损伤的主要原因。心肌细胞在缺血缺氧时,由于无氧代谢和ATP分解,环磷酸腺苷(cAMP)增加,酸性代谢物增加,导致细胞内酸中毒,激活了细胞膜调节pH的Na+/H+交换系统。随着H+外流,Na+大量内流;另一方面,由于能量缺乏,Na+-K+-ATP酶活性下降,Na+排出减少,使细胞内Na+堆积,激活了Na+/Ca2+交换系统,使Ca2+进入细胞内,形成细胞内钙超负荷[3]。此外，细胞内钙增加可激活钙依赖的磷脂酶，使膜磷脂降解，细胞膜通透性增高，自由基增加也可造成膜的损伤，致使再灌注时胞外钙大量内流。同时，缺血时能量不足使钙泵活性降低以及再灌注时氧自由基的大量产生引发膜脂质过氧化，都可以造成线粒体及肌浆网膜的损伤，致胞内钙库的大量释放细胞内钙超载。大量钙离子进入细胞内，导致细胞内钙超负荷，引发触发性心律失常；同时，细胞内钙超负荷干扰心肌电-机械收缩耦联，可使缺血部位心肌收缩过强，微血管痉挛，血管阻力增加，局部心肌血流供应障碍，进一步促使RA的发生[4]。
　　研究表明，细胞内钙离子水平升高能增加晚期后除级的发生率，引起钙转运异常，导致动作电位交替和室颤的发生[5]。钙超载还能导致NCX和NHX激活，从而进一步影响钙转运和L型钙通道的电生理特性[6]。此外，细胞内ROS水平增高能抑制Ica,L，缩短动作电位时程，导致室壁复极离散度增加，与心律失常的发生密切相关[7]。
　　近年来合成的一种新型抗心肌缺血药-曲美他嗪（Trimetazidine，TMZ），商品名为万爽力，化学名为1-（2,3,4-三甲氧苄基）哌嗪盐酸盐，它是第一个3-酮酰辅酶A硫解酶（3-KAT）抑制剂，能抑制长链脂肪酸β氧化，促进葡萄糖的有氧氧化，改善心肌细胞的能量代谢，且不会明显的增加脂质在心肌的沉积，从而更安全的发挥心肌保护作用[8]。近年研究发现[9]，对AMI患者在溶栓前先给予TMZ 60 mg/d，再灌注性心律失常为30. 1%，而对照组为56. 3%。严重的室性心律失常(如持续性室性心动过速、心室颤动的发生率在TMZ 组为1. 8%，对照组则为10.9%，差异均非常显著，这提示TMZ能减少再灌注性心律失常，提高患者的治疗效果，但TMZ对心脏离子通道影响的相关研究尚未见报到。
　　通过本项目的研究将阐明TMZ的代谢治疗在心血管疾病中的作用，将会为MIRI后心律失常的防治提供新的治疗方向，及为曲美他嗪运用于临床提供新的治疗证据。本实验通过建立心肌缺血再灌注后心律失常的动物模型，观察曲美他嗪对于心肌L型钙通道、钙离子等影响，以便验证曲美他嗪预防心律失常的作用机制，从而探讨TMZ应用于AMI介入治疗后发生不良心律失常的治疗前景。
拟解决的关键性问题
（1）L型钙通道是细胞外钙离子进入细胞内的主要途径，曲美他嗪能否减轻缺血MIRI对Ica,L的影响，恢复L型钙通道的钙调控功能，减轻与钙诱导钙释放相关的钙超载；
（2）曲美他嗪能否抑制配体诱导的钙离子内流，从而减轻细胞内钙超载；
（3）细胞内钙超载和ROS堆积互为因果，曲美他嗪能否降低MIRI后的ROS水平，从而防止脂质氧化作用破坏细胞膜结构和功能，维持膜的正常钙转运，维持线粒体和钙泵功能，减轻钙超载。
参考文献
[1]Jurkovicova O,Cagan S.Reperfusion arrhythmias[J].Bratisl Lek Listy.1998,99(3-4):162-71.
[2]Carmeliet E.Cardiac Ionic currents and acute ischemia:from channels to arrhythmias[J].Physiol Rev,1999,79(3):917-1017.
[3] Imahashi K, Pott C, Goldhaber JI,et al.Cardiac-Specific Ablation of the Na+-Ca2+ Exchanger Confers Protection Against Ischemia/Reperfusion Injury. Circ Res. 2005 Oct 28;97(9):916-21
[4 ]Yatani A, Shen YT, Yan L，et al. Down regulation of the L-type Ca2+ channel, GRK2, and phosphorylated phospholamban: protective mechanisms for the denervated failing heart [J]. J Mol Cell Cardiol, 2006,40(5):619-628.
[5]Akar JG, Akar FG. Regulation of ion channels and arrhythmias in the ischemic heart [J]. J Electrocardiol, 2007,40(6 ):S37-S41
[6]Li SZ，Wu F，Wang B, et al. Role of reverse mode Na+/Ca2+ exchanger in the cardioprotection of metabolic inhibition preconditioning in rat ventricular myocytes. Eur. J. Pharmacol, 2007,561(1-3):14-22.
[7]Ravingerova T，Slezak J, Tribulova N，et al. Free oxygen radicals contribute to high incidence of reperfusion-induced arrhythmias in isolated rat heart [J]. Life Sci,1999,65(18-19):1927-1930.
[8] Paul FK, Arnaud L, Raymond K, et al.The Antianginal Drug Trimetazidine Shifts Cardiac Energy Metabolism From Fatty Acid Oxidation to Glucose Oxidation by Inhibiting  Mitochondrial  Long-Chain  3-Ketoacyl  Coenzyme  A  Thiolase[J].  Circ Res, 2000,86（5）：580
[9]Papadopoulos CL,Kanonidis IE,Kotridis PS,et al.The effect of trimetazidine on reperfusion arrhythmias in acute myocardial infarction.Int J Cardiol,1996,55(2)：137-142
研究目标与研究内容
研究目标
我们将从以下几方面的研究实现本项目的目标：
1、通过建立Wistar大鼠缺血再灌注后心律失常动物模型，提前给予曲美他嗪处理，观察实验动物心律失常发生情况，进行再灌注心律失常评分，同时检测肌钙蛋白I的水平，明确曲美他嗪是否对心律失常有作用。
2、采用膜片钳全细胞技术，监测心肌细胞L型钙通道电流；同时检测心肌细胞内钙离子及活性氧水平，明确曲美他嗪对于心律失常的作用机制。
3、检测心肌细胞膜上Na+-K+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase活性，明确曲美他嗪是否能影响钠泵及钙泵，从而减轻钙超载，对于心律失常的作用机制。
总之，通过本项目的研究将阐明TMZ在再灌注心律失常中的作用及机理，为认识再灌注心律失常的发生机制找到新视野，为下一步研究再灌注心律失常的治疗提供新的途径和策略，扩展曲美他嗪的临床应用范围。
研究内容
项目研究内容分为两部分：⑴通过建立Wistar大鼠再灌注心律失常动物模型，研究曲美他嗪对心律失常的代谢治疗，检测以下非电生理指标：①根据Curtis-Walker心律失常评分法进行心律失常程度的评价②检测肌钙蛋白I：肌钙蛋白I是心肌的特异性结构，在正常情况下，由于心肌细胞膜保持完整，cTnI不能渗出细胞膜进入循环；而当心肌遭受缺血再灌注损伤打击时，细胞膜无法保持其完整性，cTnI可透过细胞膜释放入血，外周循环的cTnI水平增高。因而，循环中的cTnI水平是MIRI时的特异性生化标记物，相对于其他生化标记物，如乳酸脱氢酶（LDH)和肌酸激酶同工酶（CK-MB)而言，cTnI还具有检测时间早、灵敏度高和诊断窗口期长等特点。③Na+-K十-ATPase又称钠泵，是维持体内Na+、K十、Ca2+平衡的重要泵机构，对细胞能量生成过程和细胞抗损伤过程也有重要影响，具有维持正常细胞内外离子浓度梯度或电化学梯度，维持正常细胞能量代谢的作用。④Ca2+-Mg2+-ATPase又称钙泵，该酶被激活，水解ATP供能，将Ca2+泵出细胞或泵入内质网及线粒体，使细胞内Ca2+浓度下降，维持细胞内外钙离子的平衡稳定；检测以下电生理指标：采用全细胞膜片钳技术研究L型钙通道，L型钙通道是心肌细胞膜上外钙内流的主要通道，通过Ica,L进入细胞内的钙离子也是细胞内肌浆网释放钙离子的诱发因素，Ica,L的降低能抑制钙离子对肌浆网的钙调节作用，导致细胞内钙超载，易诱发早期后除极和晚期后除极，形成触发活动，导致室性心律失常；同时Ica,L也是细胞外钙内流的主要通道，对心肌收缩力、钙超载、心肌细胞凋亡等起重要影响。
（2）临床上收集急性心肌梗死接受溶栓治疗或直接PCI术后患者的临床资料，研究给予曲美他嗪组和对照组患者心律失常的发生情况，同时检测心肌酶的变化，明确曲美他嗪对于再灌注后心律失常是否有预防作用。
研究方案
一、研究曲美他嗪对于Wistar大鼠再灌注心律失常的预防效果及机制
（1）再灌注心律失常动物模型的建立
   大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉后，仰卧位固定，作气管插管，行正压人工呼吸（频率60次/分，潮气量为3.5ml），用RM-6280四道生理记录仪记录大鼠体表心电图（Ⅱ）。去胸部被毛，常规消毒后，在胸左侧第五肋间处切开胸壁，并沿胸骨左缘2mm处切断第4或第5肋骨，充分暴露心脏，然后用0号缝合针在左心耳下2mm处冠状动脉前降支穿线，于肺动脉圆锥左缘出针。将一长1.5cm，直径为1.5mm的硅胶管放在冠状动脉左前降支上方，待ECG稳定后，连同硅胶管一起结扎，造成心肌缺血，以ST段抬高为结扎成功。结扎25min后将硅胶管轻轻抽出，以缺血区心肌变红、抬高的ST段回落为再灌注成功。
（2）动物分组及处理
30只大鼠随机分为3组，每组10只，分别为假手术组（SH）、再灌注组（I/R）、TMZ干预组。所有动物均适应性喂养一周，TMZ干预组术前给予TMZ（10mg/kg/d）灌胃，Sham组和IR组给予相同体积的生理盐水灌胃。SH组冠脉穿线但不结扎，I/R及TMZ干预组手术造模。
（3）应用技术
3.1单个心室肌细胞的分离
    采用酶解法获取单个心室肌细胞，再灌注时间到后，迅速开胸取出心脏，放于 4℃无钙台氏液中，轻柔涮洗心脏血液，并游离主动脉根部，悬挂于Langendorff装置上行主动脉逆行灌注，流速为9～11ml/min，恒温（37℃）液体灌流，灌流过程中并持续充以 95%O2+5%CO2的混合气体。b.用无钙台氏液灌流5分钟，使心脏跳动停止，灌洗液清亮，灌洗净心脏残留血液。接着用含0.4mg /ml 胶原酶Ⅱ、0.03mg /ml 蛋白酶ⅩⅣ、0.9mg /ml牛血清白蛋白低钙台氏液灌注19-24min，最后用含氯化钙低钙台式液灌流5min, 5min，剪取心室组织在KB液中剪碎，吹打，用100目筛网过滤，室温下放置贴壁1小时，后置于4℃冰箱保存备用。
3.2 膜片钳技术
   通过电极拉制仪( PULL -100，美国) 拉制电极，使玻璃电极充电极内液后阻抗达到2 ～ 4MΩ。吸几滴细胞悬液加入细胞池中，细胞贴壁后选择杆状、表面光滑、纹理清晰的心肌细胞，利用三维操纵器移动电极贴近目标细胞，并轻压在细胞表面，稍加负压即可形成1GΩ水平以上的高阻抗封接，再用较大负压吸破细胞膜，形成全细胞记录形式。实验过程由刺激采集软件Pulse控制，经膜片钳放大器，通过模数转换采集数据，存放于计算机硬盘。
（4）观察指标
4.1心律失常情况：观察每组大鼠在缺血25min再灌注30min后心律失常阳性率（心律失常大鼠数量/实验大鼠总数×100%），持续时间及性质。心律失常分为室颤（VF），室速（VT），室早二联律（VES），采用Curtis-Walker心律失常评分法进行评分：0 分为不发生心律失常; 1分为持续10s以内的VES和/或VT; 2分为持续11-30 s的VES和/或VT; 3分为持续31-90s的VES和/或VT; 4分为91-180 s的VES和/或VT或持续10s以内的可逆性VF; 5分为持续180s以上的VES和/或VT或10s以上的可逆性VF; 6分为不可逆的VF。
 4.2心肌细胞内钙离子水平的测定：采用荧光指示剂Fura-2 AM进行细胞内钙离子的测定。按照试剂盒说明书将105个心肌细胞和台式液溶解的Fura-2 AM(4 uM)共同孵育
20min，采用荧光分光光度计检测劳光强度，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm，以荧光强度代表细胞内ROS水平。
4.4心肌肌钙蛋白I、Na+-K+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase的活性测定：实验结束后迅速摘取心脏，用冰生理盐水洗去残血，剪下缺血区心肌，制备成10%组织匀浆液，置于-80℃冷冻保存。标本按照试剂盒说明书测定心肌肌钙蛋白I、Na+-K+-ATPase及Ca2+-Mg2+-ATPase的活性。
技术路线
二、临床上观察曲美他嗪对再灌注心律失常的预防效果
入选标准：⑴持续性胸痛＞30 min，含服硝酸甘油不缓解。⑵心电图两个或两个以上相邻导联ST段抬高，肢体导联＞0.1mV，胸前导联＞0.2mV。⑶心肌型肌酸激酶同工酶超过正常值上限两倍，肌钙蛋白T或I阳性。⑷发病在12 h内。
排除标准：⑴对受试药品中成份过敏者。⑵心源性休克及心肺复苏史。⑶近期（＜6个月)有重大手术或外伤史、出血性疾病史、脑血管意外史。⑷既往凝血功能障碍血小板减少及贫血病史，血小板减少≤100×109/L。⑸重度肾功能不全（肌酐＞176.8umol/L），慢性血液透析。⑹高度怀疑有主动脉夹层或动脉瘤。⑺妊娠期妇女。
方法：治疗组入院时于行PCI或溶栓前给予曲美他嗪一日3次，每次20mg口服，疗程3周。治疗组和对照组均在常规治疗基础上行PCI或溶栓，溶栓患者给予尿激酶（22000U/kg）加入生理盐水100ml中，30min内静脉输入。常规治疗包括：硝酸酯类、β受体阻滞剂、低分子肝素、阿司匹林等。记录术后各种心律失常的发生情况，同时检测心肌酶的变化。　
宋玉娥