MicroRNA-21介导曲美他嗪在缺血再灌注早期抗心肌细胞凋亡作用及机制
立题依据
　　冠心病是目前全球发病率、死亡率极高的疾病，据世界卫生组织最新资料显示，中国冠心病死亡人数已列世界第二位。急性心肌梗死是冠心病中最为凶险的类型，目前治疗最有效的方法是药物溶栓或者通过介入、血管搭桥的再灌注治疗，但随之而来的再灌注损伤是治疗中无法避免的问题。缺血再灌注损伤中细胞凋亡是重要环节[1]，1994年Gotilieb等在兔心肌缺血-再灌注损伤模型中首次发现了细胞凋亡[2]，随后Fliss等先后报道持续缺血可引起心肌细胞凋亡，但缺血-再灌注使得凋亡明显增加[3]。缺血再灌注过程中细胞凋亡的机制尚不完全清楚, 可能与氧自由基的大量生成、细胞内钙离子的超载、线粒体损伤以及中性粒细胞的浸润等因素有关。缺血再灌注过程中细胞凋亡主要通过线粒体途径，介导心肌缺血/ 再灌注损伤细胞凋亡的信号转导途径十分复杂，磷脂酞肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B，又名AKT ) 相关通路是最重要的通路之一。
　　曲美他嗪是抗心肌缺血的重要药物。Ihsane报道在冠状动脉旁路移植术前给予曲美他嗪，可明显降低术后心肌损伤标志物水平，提示曲美他嗪可减少心肌损伤[4]；陈韵岱等报道在国内5家中心进行的PCI（percutanious coronary interventions，PCI）围手术期临床研究，应用曲美他嗪可以减少术中心绞痛发作,减轻心肌损伤,进一步改善PCI术后的左心功能[5]；动物及细胞实验也证实其降低缺血再灌注心肌细胞凋亡[6,7]。而对于曲美他嗪抗缺血-再灌注损伤的基础研究集中于细胞水平的代谢机制，认为曲美他嗪对抗细胞凋亡作用主要通过降低游离脂肪酸的氧化速率，促进葡萄糖氧化途径，减少高能磷酸盐生成过程中对氧的需求，维持三磷酸腺苷的产生和缺血心肌细胞的能量代谢 [8]。但近年来曲美他嗪的非代谢机制日益受重视。Tritto等[9]报道曲美他嗪可以抑制中性粒细胞活性而保护缺血心肌；Vijay K等[10]发现曲美他嗪可以清除活性氧（Reactive OXyen Species，ROS）从而减轻心肌缺血再灌注损伤；Pericle DN等[11]报道曲美他嗪在缺血再灌注大鼠中通过维持内皮一氧化氮合酶表达发挥心脏保护作用。以上结果提示，曲美他嗪是改善缺血再灌注损伤的重要药物，深入探讨其作用机制有重要意义，尤其是寻找其新的非代谢机制可以为临床应用提供更充分的依据，促进缺血再灌注损伤临床治疗的发展。
　　MicroRNA是一类内源性、非编码、单链RNA，参与心血管系统的生理及多种病理过程。MicroRNA通过结合到靶基因的mRNA的3，非翻译区（3，-UTR），介导靶基因mRNA降解、抑制或增强其蛋白质翻译，从而调控转录后的基因表达。miR-21是心脏高表达的microRNA。Tang等[12]发现在小鼠缺血30分钟，再灌注24小时心肌组织，miR-21表达下降；Dong等[13]观察到大鼠持续缺血6小时、24小时的心肌梗死区miR-21表达下降，而经过缺血预处理后梗死区miR-21的降低得到改善，通过腺病毒转染过表达miR-21可以减少心肌细胞凋亡，减少梗死面积；在新生大鼠心肌细胞过表达miR-21可减少H2O2所致的心肌细胞凋亡[14]。本研究小组前期动物实验已发现大鼠缺血再灌注早期心肌缺血区miR-21表达下降，通过冠脉灌注法转染9型腺相关病毒（AAV9）包装的pre-miR-21的方法过表达miR-21后，缺血区细胞凋亡明显改善，提示miR-21在缺血-再灌注损伤时有抗细胞凋亡作用。PTEN是已经证实的miR-21的靶基因[15,16]，主要调控PI3K/AKT信号通路[17,18]，而该信号通路正是细胞凋亡过程最重要的信号通路。鉴于miR-21在缺血再灌注损伤中的作用，我们假定在缺血再灌注损伤时，曲美他嗪可能部分由miR-21介导实现抗细胞凋亡作用，并观察miR-21的靶基因PTEN及下游信号通路PI3K/AKT的变化，进一步进行机制探讨，从而为临床缺血再灌注损伤的治疗提供新的思路与方法。
　　综上所述，本项目提出下述假设：miR-21可能通过PTEN/PI3K/AKT介导了曲美他嗪发挥缺血再灌注损伤时抗细胞凋亡作用。在缺血再灌注时存在心肌细胞凋亡，曲美他嗪可抑制心肌细胞凋亡；过表达或者抑制miR-21后，可增强或者减弱曲美他嗪的抗凋亡作用；进一步将miR-21的靶基因PTEN基因沉默后曲美他嗪的抗凋亡作用减弱。本项目以心肌缺血再灌注早期大鼠模型及缺氧-复氧H9C2细胞为研究对象，经曲美他嗪预处理，采用免疫组化及TUNEL、WB方法观察心肌组织、细胞凋亡及凋亡蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的水平，同时使用q-PCR、Western-blot检测miR-21、PTEN及信号通路PI3K/AKT水平；用Lipofectamin2000转染miR-21inhibitor和miR-21mimic至心肌细胞，观察抑制和过表达miR-21后对曲美他嗪抗细胞凋亡作用的影响以及PTEN、PI3K/AKT的变化，探讨miR-21是否介导曲美他嗪在缺血-再灌注早期抗凋亡作用及可能参与的下游通路；进一步用Lipofectamin2000转染PTEN-siRNA至H9C2细胞，曲美他嗪干预并细胞缺氧-复氧后，观察敲除PTEN对曲美他嗪抗细胞凋亡作用的影响，证实miR-21介导曲美他嗪抗细胞凋亡部分通过该通路。本项目根据申请者本人及研究小组前期研究发现，结合国际上最新文献报道深入思考提出。开展本研究，可望揭示缺血再灌注损伤中曲美他嗪通过miR-21的介导，进一步调控其靶基因PTEN及PI3K/AKT信号通路发挥抗心肌细胞凋亡作用，为曲美他嗪在缺血再灌注损伤早期抗细胞凋亡作用提供新的线索及证据。
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研究目标与研究内容
研究目标
（1）探讨缺血再灌注早期时曲美它嗪的抑制心肌细胞凋亡作用。
（2）抑制、过表达miR-21时对曲美他嗪在缺血再灌注早期抗心肌细胞凋亡作用的影响。
（3）阐述miR-21介导曲美他嗪抑制缺血再灌注早期抗细胞凋亡的机制。
研究内容
（1）以大鼠心肌缺血-再灌注模型为研究对象，观察曲美他嗪预处理后细胞凋亡及miR-21水平的影响。用TUNEL检测细胞凋亡指数，WB检测Bcl-2、Bax、Caspase-3水平，q-PCR方法检测miR-21的表达变化。
（2）以缺氧-复氧H9C2细胞为研究对象，观察曲美他嗪处理后细胞凋亡及miR-21水平的影响。用TUNEL检测细胞凋亡指数、WB检测Bcl-2、Bax、Caspase-3的水平，q-PCR方法检测miR-21的表达。
（3）以缺氧-复氧H9C2细胞为研究对象，观察抑制及过表达miR-21后对曲美他嗪抗细胞凋亡作用的影响及可能参与的下游通路。转染miR-21inhibitor及miR-21mimic并曲美他嗪干预后，用TUNEL计算凋亡指数，WB检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、PTEN、p-AKT的蛋白表达，q-PCR方法检测miR-21、PTENmRNA的表达变化。
（4）以缺氧-复氧H9C2细胞为研究对象，观察PTEN基因沉默对曲美他嗪抗细胞凋亡的影响以证实下游信号通路。转染PTEN-siRNA并曲美他嗪干预后，TUNEL检测细胞凋亡指数，q-PCR方法检测PTENmRNA变化，用WB等方法检测PTEN、p-AKT、Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达变化，
研究方案
研究对象、研究方法和技术路线
（1）以大鼠心肌缺血再灌注模型为研究对象，采用免疫组化、TUNEL及WB等方法，观察缺血再灌注心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达，采用q-PCR方法检测miR-21的表达变化，曲美他嗪处理后上述指标的变化
（2）以缺氧-复氧的H9C2细胞为研究对象，用TUNEL、WB方法检测细胞凋亡指数及Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达，q-PCR方法检测miR-21的表达变化。曲美他嗪处理后，细胞凋亡的变化及miR-21的表达变化（3）以缺氧-复氧H9C2细胞为研究对象，观察抑制及过表达miR-21后对曲美他嗪抗细胞凋亡作用的影响及可能参与的下游通路。转染miR-21inhibitor及miR-21mimic并曲美他嗪干预后，用TUNEL检测细胞凋亡指数，WB方法检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、PTEN、p-AKT的表达，q-PCR方法检测miR-21、PTENmRNA的表达变化
（4）以缺氧-复氧H9C2细胞为研究对象，观察PTEN基因沉默对曲美他嗪抗细胞凋亡的影响以证实下游信号通路。转染PTEN-siRNA并曲美他嗪干预后，TUNEL观察细胞凋亡指数，q-PCR方法检测PTENmRNA变化，用WB等方法检测PTEN、p-AKT、Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达变化统计方法
　　采用SPSS13.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ ）表示，对计量资料进行正态性检验。两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析，多组间均数的两两比较采用LSD-t检验或SNK-q检验。计数资料用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
杨琼