曲美他嗪对脓毒症心肌病的保护作用及机制研究
立题依据
（包括国内外研究现状、研究意义、拟解决的关键问题，限1000~2000字，附主要参考文献目录）
　　脓毒症是指各种致病微生物或其毒素存在于血液或组织中，是机体对感染的一种全身性炎性反应，进一步发展可导致感染性休克和多器官功能障碍综合征， 是临床危重症患者死亡的主要原因之一 [1]。脓毒症患者中有40%～50%合并心脏功能不全，其中出现严重心力衰竭者约占7% [2]。迄今为止，其发生机制尚未定论。细菌毒素、细胞因子等通过不同的途径造成心肌灌注不足、心肌能量代谢障碍及心肌细胞凋亡等，是脓毒症导致心脏损伤的重要机制 [3]。心肌能量代谢障碍是脓毒症心肌病心肌细胞损伤的始动环节，是引起和促进心功能障碍发生、发展的重要因素。目前认为以下因素参与其中：
1. 线粒体功能损伤：心肌线粒体是心肌能量代谢的主要场所，脓毒症时心肌线粒体也发生了一系列变化，线粒体功能障碍（如氧化磷酸化损伤、Ca2+超载）是心肌能量代谢改变的关键机制 [4,5]。在严重脓毒症病程中降低的是细胞氧耗而非组织氧供。由于>90%氧耗用于线粒体生成三磷酸腺苷( adenosinetriphosphate, ATP)，因此，线粒体功能障碍可能在脓毒症心肌抑制中有重要作用。
2. 心肌脂类代谢紊乱：正常心肌ATP来源于线粒体氧化代谢，其中脂肪酸为60%～80%，丙酮酸氧化为10%～40%，糖酵解很少 [6,7]。脓毒症时心肌细胞能量氧化代谢由优先利用游离脂肪酸(free fatty acid, FA)变为优先利用葡萄糖供能 [8]。FA 氧化减少的原因是过氧化合物酶体增值激活受体活性降低而引起参与FA 运输与代谢的基因表达下调。
3. 心肌糖代谢异常：脓毒症时心肌能量代谢的底物发生改变，由优先利用FA 变为优先利用葡萄糖作为能量代谢的底物 [9]。尽管FA作为能量来源不如葡萄糖有效，需要多消耗10%的氧才能产生等量的ATP，但FA 氧化减少并不能完全被葡萄糖代谢增强所代偿。脓毒症时心肌细胞酶学发生改变，可导致心肌糖代谢异常和心肌存在进行性的能量衰竭，最终导致心脏功能的降低 [10]。
　　因此，深入了解脓毒症心肌病致心肌损伤的病理生理机制，阐明能量代谢障碍在其中的作用，是治疗感染性休克心肌抑制的核心问题。
　　曲美他嗪，通过调控代谢途径，已被证实能够作为抗心肌缺血或细胞保护剂有效的治疗慢性稳定型心绞痛和左心室功能障碍。曲美他嗪能够抑制长链3-酮酰辅酶A硫解酶(3-KAT)在心肌细胞中的β-氧化途径，是其关键的药理作用 [11]。这将使得心脏代谢由游离脂肪酸氧化转为葡萄糖氧化--在耗氧量和能量（三磷酸腺苷）生产方面更有效的代谢途径。有研究证实曲美他嗪，可缓解心肌功能障碍，因为它能够增加葡萄糖和乳酸的利用率，减少心肌氧消耗总量的16-26% [12]。
　　在我们的前期研究基础中，我们发现：曲美他嗪通过激活AMPK、降低PGC-1α的表达，逆转心脏的脂毒性、改善氧化能够显著的保护糖尿病小鼠（db/db）的心功能 [13]。基于以上的研究结果，我们提出假设：在脓毒症心肌病一类的代谢性心脏病中，曲美他嗪是否也具有保护治疗作用呢？
　　本研究拟以心肌细胞和整体动物为对象，应用PCR、western-blot和免疫组化等技术，从分子、细胞和整体水平明确：
1. 曲美他嗪在脓毒症心肌病治疗中的重要作用；   
2. 曲美他嗪治疗脓毒症心肌病的作用机制。
通过上述问题的深入研究，为全面认识脓毒症心肌病的病理生理机制及曲美他嗪对脓毒症心肌病的治疗提供依据。
参考文献
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10. Chew MS, Johansson A, Anderson C, Ersson A, Tonnesen E (2008) Decreases in myocardial glucose and increases in pyruvate but not ischaemia are observed during porcine endotoxaemia. Acta Anaesthesiol Scand 52: 959-968.
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三、研究目标与研究内容
研究目标：
　　本研究旨在揭示心肌能量代谢在曲美他嗪调控下，经由线粒体功能对内毒素血症诱导的脓毒性心肌病心肌抑制的重要调控作用，阐释脓毒性心肌病心肌抑制病理生理机制的重要分子基础，并提供新的治疗靶点及方案。为此我们确定了2个具体的研究目标：
1. 确证曲美他嗪对脓毒性心肌病心肌抑制的治疗作用；
2. 确证曲美他嗪对脓毒性心肌病心肌抑制中心肌氧化应激、线粒体功能的调控作用。
研究内容：
　　在分子、细胞和整体水平，应用动物模型和心肌细胞，从以下几方面完成拟定的研究目标：
1.建立盲肠结扎穿孔法诱导的大鼠脓毒症模型，并利用相关生化指标，结合病理学改变，将心肌抑制损伤分为损伤早期、严重损伤期及恢复期；
2. 分别通过灌胃予以低剂量曲美他嗪（5mg/kg/d）和高剂量曲美他嗪（20mg/kg/d）治疗，与对照组相比评价心肌组织损伤与心功能。研究对不同时期氧化应激反应、线粒体损伤、能量代谢的影响：
1）心肌损伤检测指标：Millar导管血流动力学检测、心肌形态学检测，心肌酶谱检测；
2）氧化应激检测指标：ROS检测、H2O2、MDA；
3）线粒体损伤检测指标：形态学、UCPs表达、ATP合成、线粒体膜通透性转换孔（MPTP）开放性、线粒体跨膜电位检测（JC-1）、细胞凋亡检测，并检测曲美他嗪对线粒体功能的调控作用；
4）心肌能量代谢检测：血清和心肌游离脂肪酸水平测定；心肌组织中能量代谢通路关键分子的表达：PPARα/PGC-1复合体、CPT-1、GLUT-4、AMPK。
3. 采用H9c2心肌细胞系和原代心肌细胞给予LPS和TNF-α干预，建立内毒素诱导的心肌细胞损伤模型。分别给予曲美他嗪、AMPK siRNA/抑制剂，与对照组相比检测对心肌损伤、氧化应激反应、线粒体损伤、能量代谢的影响：
1）细胞损伤检测指标：TUNEL、Annexin V/PI染色；
2）氧化应激检测指标：ROS检测、MDA、SOD；
3）线粒体损伤检测指标：MPTP开放性、JC-1；
4）能量代谢检测指标：游离脂肪酸水平测定；PPARα/PGC-1复合体、CPT-1、GLUT-4。
四、研究方案（包括研究对象、研究方法、技术路线、统计方法等）
研究方案：
1. 动物模型建立：
1）盲肠结扎穿孔法诱导的大鼠脓毒症模型：SPF环境饲养大鼠术前12小时禁食不禁水，腹腔注射1%戊巴比妥钠40mg/kg麻醉，仰卧位固定于操作台。碘伏消毒皮肤，于大鼠腹部正中切开5cm长切口，沿腹白线剪开腹膜，找到盲肠后，轻轻提出腹腔外，置于无菌湿纱布保护。于回盲瓣中远1/3处结扎盲肠，并避免结扎损伤血管。把结扎的盲肠内容物轻轻挤至一端，以14#针头穿破盲肠，再以同样方法于盲肠另一端以14#针头穿刺。轻轻挤压盲肠使穿刺处有少许粪便溢出，分两层缝合腹壁。
2）动物分组：control组（空白对照）、sham组（假手术，手术时打开腹腔，找到盲肠，但不予结扎和穿孔）、CLP组（盲肠结扎穿孔组）、CLP+曲美他嗪低剂量治疗（5mg/kg/d，灌胃）、CLP+曲美他嗪高剂量治疗（20mg/kg/d，灌胃）、
3）心肌抑制损伤分期：CLP术后12小时，大鼠病情加重；24小时候出现重症感染的一系列临床表现。CLP模型制备成功后，24小时内即出现小鼠死亡，其中24小时后上升较快。于12h、24h、48h、72h、96h采集外周血标本。分急性损伤组、重度损伤组和损伤恢复组取器官标本，另保存死亡组器官标本。
2. 体内检测指标：
1）心肌损伤检测指标
Millar导管血流动力学检测：小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉，固定于小动物手术台；颈部正中剪一长约2cm的竖形切口，钝性分离各层组织，暴露右颈总动脉鞘后，小心游离约1cm长的颈动脉；结扎颈动脉远心端，动脉夹夹闭近心端。在远心端作一斜形向心切口，将前端带有电极的P-V微导管（SPR-838, Millar Instruments, Houston, TX）经右颈总动脉插入至主动脉，导管通过压力-容积传导系统（Millar instruments）连接PowerLab/4SP A/D 转换器与MS-302多媒体生物信号采集分析系统连接，动态观察压力波形变化，稳定数分钟后记录动脉波形；将导管缓慢向左心室送入，根据监视仪上显示的波形变化，直至出现较好的压力-容积环图形，确认导管进入左心室后固定导管。小鼠稳定20分钟，连续记录压力、容积变化，以获得稳态的血流动力学数据。血流动力学数据经压力-容积分析软件（PVAN）处理后获得，观察指标包括心率（HR）, 左室收缩末压（LV end-systolic pressure, LVESP），左室舒张末压（LV end-diastolic pressure, LVED P），左室压力最大上升和下降速率（±dP/dt max）。
　　心肌形态学检测：留取各组动物心肌组织标本，10%甲醛固定，经脱水包埋后，组织切片进行HE染色，显微镜下观察心肌形态、结构是否变化。
心肌酶谱检测：ELISA试剂盒检测血清肌酸激酶（CK）、心肌肌钙蛋白（cTnI）活性。
2）氧化应激检测指标
　　常规冰冻切片心肌组织，与超氧化物阴离子荧光探针避光孵育检测ROS，荧光显微镜采集图片，软件计数。过氧化氢（H2O2）水平利用Amplex Red assay试剂盒（Molecular Probes, Invitrogen, Carlsbad, CA）进行检测。采用特异性试剂盒（南京建成）检测丙二醛（MDA）水平。
3）线粒体损伤检测指标：
　　电镜检测组织切片中线粒体的形态学，western-blot检测UCPs表达，ELISA试剂盒检测ATP合成，罗丹明123检测线粒体膜通透性转换孔（MPTP）开放性，JC-1试剂盒检测线粒体跨膜电位、caspase-3/9检测线粒体通路细胞凋亡。
4）心肌能量代谢检测：采用南京建成试剂盒检测血清和心肌游离脂肪酸水平；western-blot检测心肌组织中能量代谢通路关键分子的表达：PPARα/PGC-1复合体、CPT-1、GLUT-4、AMPK。
3. 体外检测指标：
1）细胞培养：采用含10%胎牛血清的H-DMEM培养基培养H9c2心肌细胞系。
原代心肌细胞培养：无菌条件下开胸取出SD乳鼠（1-3d）心脏，剪碎1-3mm3大小，以0.08%胰蛋白酶消化5min左右，10%胎牛血清培养基终止消化，反复数次，直至碎片完全消化。将细胞以培养基悬浮，收集于培养瓶中，差速贴壁60min后，吸取未贴壁细胞至新培养瓶中。心肌细胞培养48h后，加入0.1mmol/L的5-BrdU，以抑制非心肌细胞的生长。镜下观察细胞跳动及免疫组化α-actin鉴定心肌细胞。
2）细胞分组：control、LPS、LPS+曲美他嗪、LPS+曲美他嗪+AMPK siRNA/抑制剂、TNF-α、TNF-α+曲美他嗪、TNF-α+曲美他嗪+AMPK siRNA/抑制剂。
3）细胞损伤检测指标：
　　TUNEL试剂盒（Roche，USA）检测细胞凋亡；Annexin V/PI双染试剂盒（南京凯基）检测细胞凋亡；ELISA试剂盒检测Caspase-3/9活性。
4）氧化应激检测指标：
　　采用DCF探针检测ROS含量；南京建成试剂盒检测MDA、SOD不同亚型的表达量。
5）线粒体损伤检测指标：
罗丹明123检测MPTP开放性，JC-1试剂盒检测线粒体跨膜电位。
6）能量代谢检测指标：
　　采用南京建成试剂盒检测血清和心肌游离脂肪酸水平；western-blot和real-time PCR检测心肌组织中能量代谢通路关键分子的表达：PPARα/PGC-1复合体、CPT-1、GLUT-4、AMPK。
陈琛