应用核磁共振技术评价曲美他嗪在心脏缺血-再灌注中的保护作用
立题依据
　　目前临床上急性心肌缺血及急性心肌梗塞仍然是心血管专业死亡率最高的疾病。随着冠状动脉介入和溶栓技术的发展和迅速普及，冠状动脉急性闭塞后的再通率有了大幅度提高，但医学界期盼的冠心病死亡率根本性的下降却未能实现。而导致急性心肌梗塞死亡率仍居高不下的主要原因是心肌细胞缺血-再灌注损伤引起的心力衰竭和心律失常。如何有效防治急性心肌缺血及再灌注损伤后的各种并发症并进一步降低死亡率是目前困扰心血管基础和临床研究的一个难题 。而解决这一难题的关键是如何提高心脏对于缺血-再灌注这一应激过程的耐受程度。
　　目前的研究显示，维持心肌细胞内一定水平的腺苷三磷酸（ATP）浓度是心肌细胞正常收缩和舒张的必需条件。关于心脏缺血-再灌注损伤机制的研究显示，多种代谢机制参与了缺血-再灌注损伤，但缺血-再灌注后心肌细胞内ATP合成功能的恢复延迟是导致再灌注后心肌细胞功能障碍的主要原因。越来越多的研究显示，ATP浓度变化发生在缺血的即刻，早于细胞内H+浓度、PH值的变化，随着缺血时间的延长及ATP浓度降低到一定程度，才能进一步开启细胞内一系列应激相关代谢过程，关闭部分功能代谢过程，从而维持细胞内的ATP浓度，使它们可以度过缺血、缺氧的难关；即使细胞随后恢复了再灌注，缺血和缺氧得到了缓解，但此时由于细胞内已经堆积了大量酸性代谢产物，细胞内正常的代谢过程仍不能很快启动，更为严重的是，随着血流的恢复，这些缺血部位的酸性代谢产物进入了正常细胞内，使这部分组织也失去了正常的功能，整个心脏的收缩和舒张功能在灌注恢复后反而更加恶化。因此，尽早恢复正常代谢过程，并快速提高细胞内ATP的浓度是再灌注后保存心肌细胞功能和恢复心脏整体功能的关键。
　　心脏耗能位居所有器官之首,成人心脏收缩大约每日平均10万次，泵出血液约8千升，心脏通过能量代谢将储存在脂肪酸或葡萄糖中的化学能转化为机械能，心脏每天需要通过代谢获得6吨ATP。在正常的心肌细胞内，ATP的生成主要依赖脂肪酸的氧化 （占60%-70%），其次依靠葡萄糖氧化（占20%-30%），而在缺氧缺血时，心肌细胞内ATP的生成主要源于葡萄糖氧化。然而，目前尚不明确在缺血后的再灌注过程中，心肌细胞内能量合成的底物以什么为主。
　　目前临床上常用的改变心肌细胞内能量代谢底物的药物包括增加葡萄糖代谢的曲美他嗪，增加脂肪酸代谢的左卡尼汀。曲美他嗪因为服用方便，副作用少，目前已经作为心绞痛发作的常规预防性治疗。虽然已经有一些临床实验显示在急性冠脉综合症的患者中早期应用曲美他嗪可以改善患者的预后，但目前尚缺乏基础和临床深入的实验依据，大大限制了该药物的临床应用范围。
　　本研究旨在探讨缺血-再灌注这一病理生理改变过程中，心肌细胞内能量代谢底物的重构，同时探讨人为地改变这一过程中能量代谢的底物，即通过应用曲美他嗪增加心肌细胞的葡萄糖氧化，减少脂肪酸氧化，利用核磁共振波谱连续动态观察对心肌细胞ATP浓度的影响，以及由此引起的心脏收缩及舒张功能的变化。
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研究目标与研究内容
研究目标
1.探讨心脏缺血-再灌注过程中葡萄糖氧化及脂肪酸氧化的动态变化。
2.探讨心脏缺血-再灌注过程中，万爽力增加葡萄糖氧化后引起的心脏ATP动态变化及对心脏收缩和舒张功能的影响。
研究内容
1.心脏缺血-再灌注过程中葡萄糖氧化及脂肪酸氧化的动态变化。
在正常心肌细胞内，ATP的产生主要依靠游离脂肪酸的有氧氧化，占60%-70%，而在心脏缺血及缺氧过程中，心脏的能量代谢底物发生了重构，葡萄糖有氧氧化增加，脂肪酸氧化抑制，以便在有限的供氧调节下，产生更多的ATP，以维持细胞内ATP的浓度，保证细胞的基本功能。而缺血后的再灌注过程中，心肌细胞内的缺血和缺氧得到了缓解，但此时由于细胞内已经堆积了大量酸性代谢产物，细胞内正常的代谢过程仍不能很快启动，更为严重的是，随着血流的恢复，这些缺血部位的酸性代谢产物进入了正常细胞内，使这部分组织也失去了正常的功能，整个心脏的收缩和舒张功能在灌注恢复后反而更加恶化。目前尚不清楚再灌注过程中ATP的产生主要依赖于葡萄糖氧化还是脂肪酸氧化，本研究将利用13C动态标记跟踪葡萄糖的氧化过程，并应用核磁共振波谱连续监测心脏ATP的浓度，由此判断心脏能量代谢底物的动态改变，同时由实时的左心室压力变化判断这一过程对心脏功能的影响。
2.应用万爽力增加心肌细胞内葡萄糖代谢后，心脏缺血-再灌注过程中ATP的生成变化及对心功能的影响。
心脏缺血过程中，心脏处于应激状态，AMPK等代谢相关的酶链系统激活，葡萄糖代谢增加，脂肪酸代谢减少，而曲美他嗪可以选择性的抑制3-KAT活性，进一步减少脂肪酸氧化。本研究将观察应用万爽力后，心脏在缺血过程中葡萄糖氧化的增加是否能产生更多的ATP，尤其是再灌注过程中，万爽力是否能引起葡萄糖氧化的增加，是否有利于细胞内ATP浓度的提高，从而有利于心脏收缩和舒张功能的早期恢复。
研究方案
1.实验动物：
选择出生6-8周的正常对照小鼠各15只为实验对象，按年龄和性别匹配为用药小鼠组和正常对照小鼠组。用药组给予万爽力口服14天，正常对照组给予同等量淀粉。
2.实验方法和步骤：
2.1实验步骤：
2.1.1基础状态（20分钟）：
本研究采用Krebs-Henseleit缓冲液为灌注液，Langendorff常规灌注装置灌注两组离体小鼠心脏。腹腔内注射苯巴比妥钠麻醉小鼠，快速分离小鼠心脏并置于4℃ Krebs-Henseleit缓冲液，缓冲液组成为：氯化钠（NaCl）118mmol/L,碳酸氢钠（NaHCO3 ）25 mmol/L，氯化钾（KCl）5.3 mmol/L,氯化钙（CaCl2）2.5 mmol/L,硫酸镁（MgSO4）1.2 mmol/L,EDTA0.5 mmol/L，葡萄糖（Glugose）10 mmol/L，Pyruvate 0.5 mmol/L。小鼠主动脉连接灌注装置，予Krebs-Henseleit有氧灌注液并恢复正常心跳，左心室内插入微型气囊并连接计算机连续纪录左心室内压力变化曲线，将灌注压衡定于80mmHg灌注20分钟。在基础状态末快速液氮冻存5只用药组和正常组的小鼠心脏。
以Krebs-Henseleit缓冲液为灌注液，核磁共振内的Langendorff灌注装置灌注两组离体小鼠心脏；应用自制的定位装置将小鼠心脏固定在核磁共振内精确的位置上（必须置于特定的约2-3cm3区域内），同时保证小鼠心脏温度、氧供等灌注条件恒定。
2.1.2心肌缺血状态（20分钟）：
   通过“三通连接开关”完全阻断连接主动脉的灌注液，达到心脏完全缺血的目的，缺血持续20分钟。在缺血状态末快速液氮冻存5只用药组和正常组的小鼠心脏。
2.1.3葡萄糖和脂肪酸灌注液再灌注状态（30分钟）
   缺血结束后，立即恢复主动脉灌注，并持续30分钟。（灌注转用药组和正常组小鼠各5只，再灌注状态末快速液氮冻存5只用药组和正常组的小鼠心脏。）：
2.2心脏基本功能指标测定：
2.2.1左心室压力曲线记录：
    通过插入左心室的自制微小气囊连接压力感受器，连续记录左心室的舒张末期压力、左心室收缩末期压力、心率等变化。
2.2.2冠状动脉血流：
应用PVC导管收集并测量冠状动脉血流。
2.3高压液相波谱分析：
　　三个阶段末留取的心肌标本内ATP，AMP,ADP,Adenosin等的含量由HPLC测定。心肌内的糖原、脂肪酸等由分光光度计测量。上述所有指标的测量由20-30mg的心肌固定标本完成，应用每克组织湿重含0.15克蛋白质，每克蛋白质含0.48ml细胞内间液的标准推算整体心脏含量。
2.4核磁共振测量分析：
　　将恢复心跳的小鼠离体灌注小鼠心脏固定在特制的试管内，再将该试管固定在波谱采集管内并置入核磁共振系统，对磁场匀场后，以水的信号为标准，将1H线圈调为31P，然后对成像区域内的自由感应衰减信号进行傅利叶转换，连续采集跳动的小鼠心脏31P核磁共振波谱，通过相位校正，由计算机分别测量ATP浓度、葡萄糖摄取率、Phi等指标。
3.统计学分析和处理：
　　对比分析用药小鼠和正常对照小鼠在基础状态、缺血、以及再灌注过程中心肌细胞内ATP的浓度变化；分析上述各种状态用药组小鼠和正常小鼠心脏功能的改变；判断万爽力在缺血、再灌注过程中发挥的作用。
邢艳秋