曲美他嗪在糖尿病心肌病预防中的作用
立题依据
　　糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病主要的心血管并发症之一，发病率高，危害性大，与糖尿病患者心血管疾病的高发生率和高病死率密切相关[1]。DCM的发病机制十分复杂，心肌代谢异常被认为是DCM发生的始动因素[2]，代谢异常、氧化损伤等多种因素相互作用可导致心肌结构和功能改变，引起心室舒张和（或）收缩功能受损，最终导致心力衰竭。动物实验证明，无论是在1型还是2型糖尿病中，心肌代谢改变均发生在病变早期阶段，即使早期心脏代谢损伤发生在细胞或亚细胞水平，不足以导致心肌功能改变，但心肌受损累积超过一定时间就会导致DCM[3]。目前，针对DCM的干预主要包括血糖、血脂的控制和RAAS系统抑制剂及β-受体阻滞剂的应用。然而，由于DCM潜伏性的临床病程，早期多无明显临床表现，一经确诊后心功能通常已明显受损，此时治疗相对乏力，预后较差[4]。因此，如果在糖尿病初期即开始实施具有针对性的预防治疗，则有望阻止或减少DCM的发生发展，有效改善患者预后。
　　心肌细胞凋亡是DCM发生发展的重要病理生理机制：DCM是由代谢异常所致的弥漫性心肌损害，近年来，越来越多的证据表明，心肌细胞凋亡是有效心肌收缩单位丢失的主要原因，而心肌组织中心肌细胞丢失是造成心力衰竭最重要的因素。由于成体心肌细胞只有极少数心肌细胞可以分化增生，因此，在DCM进程中，心肌细胞凋亡增加可引起以下病理生理后果：1.减少心肌细胞数量，使心肌收缩单位逐步减少，导致心脏收缩功能障碍；2. 使心肌收缩单位减少，促进心肌细胞代偿性增生，引起心室肥厚及心脏重构，导致心脏舒张功能不全。研究表明，糖尿病患者心肌细胞凋亡率为0.08–0.25%，正常对照组仅为0.001–0.002%[5,6]。虽然组织学检测心肌组织中心肌细胞凋亡率较低，但长期的细胞凋亡也可因心肌细胞持续性丢失，引起心功能障碍。由此可见，心肌细胞凋亡在DCM发病过程中具有明确的作用，但是目前人们对糖尿病状态下心肌细胞凋亡的诱导机制仍知之甚少。
　　氧化应激是促使心肌细胞凋亡的重要因素：2001年Brownlee教授提出“线粒体超氧化物产生过多是糖尿病并发症的统一机制”，氧化应激是胰岛素抵抗、糖尿病和心血管疾病的“共同土壤”[7]。糖尿病状态下，心肌细胞对葡萄糖的利用明显下降，转而过度依赖脂肪酸的β氧化[8]。这种耗氧量增高的代谢模式使心肌细胞缺氧状态加重和心肌细胞内神经酰胺浓度升高，诱导活性氧（reactive oxygen species，ROS）聚集，内皮性一氧化氮减少，诱导性一氧化氮增多，促进心肌细胞凋亡，导致心脏功能下降[9]。研究表明，在1型和2型糖尿病中，ROS的生成均明显增加[10]。过多的ROS不仅可以通过损害心肌细胞膜，使膜的完整性、流动性和通透性改变而损伤心肌细胞，还可以引起线粒体脱偶联，造成线粒体功能异常，损害心肌细胞的能量代谢[11]，并可作用于异位沉积的脂肪而发生脂质过氧化，通过脂毒性进一步损害心脏的结构和功能[12]。研究表明，除直接诱导心肌细胞凋亡外，氧化应激还可以介导凋亡相关基因的表达调控和参与细胞内相关信号通路的转导[13]，ROS生成过多和抗氧化系统受损可诱发氧化损伤的各种途径，而使用抗氧化剂可降低心肌组织中心肌细胞凋亡，预防或减轻DCM心功能恶化[14]。
　　曲美他嗪（trimetazidine，TMZ）是一种促心肌能量代谢药物，可选择性抑制线粒体长链3－酮酰基辅酶A 硫解酶（3-ketoacyl coenzyme A thiolase，3-KAT）的活性，从而部分抑制长链脂肪酸的β氧化，使之向葡萄糖氧化转变，优化心肌的能量代谢。同时，除代谢作用外，实验证明TMZ还具有稳定线粒体功能、降低氧化损伤等非代谢作用[15,16]。有研究表明，TMZ可减少db/db小鼠心肌中ROS的生成和由此产生的脂质过氧化，改善db/db小鼠的心脏功能[17]，并可减少细胞色素C从线粒体漏出，降低心肌缺血再灌注模型中ROS导致的心肌细胞凋亡[18]。作为代谢治疗的代表性药物，TMZ从多个方面均显示出了良好的心肌保护作用，已被广泛应用于冠状动脉粥样硬化性心脏病、缺血性心肌病、心力衰竭、介入相关心肌损伤等疾病的治疗中。由于TMZ不影响其他药物的使用，并可以在不改变血流动力学参数的情况下发挥作用，而且很少发生副反应[4]，如果作为DCM的预防用药将具有非常广阔的前景。
综上所述，我们提出假设：糖尿病状态下早期应用TMZ可改善心肌能量代谢，降低心肌细胞的氧化损伤，从而减少心肌细胞凋亡，保护心功能，阻止或减少DCM的发生发展。本课题拟建立DCM的大鼠模型，观察TMZ对心肌细胞代谢和氧化应激的调节作用，探讨早期应用TMZ是否可以通过减少心肌细胞凋亡而保护DCM大鼠的心脏结构和功能。
参考文献
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研究目标与研究内容
1.研究目标：
（1）以2型DCM大鼠为模型，从整体动物水平验证早期应用TMZ可以保护心功能，阻止或减少心力衰竭的发生；
（2）利用分子生物学及组织形态学手段，验证早期应用TMZ可以改善心肌能量代谢，调节心肌氧化应激，减少心肌细胞凋亡；
（3）初步探讨TMZ作用于DCM的具体机制，为TMZ应用于2型DCM的预防提供理论依据。
2.研究内容：
根据文献方法，采用高脂饮食合并小剂量链脲菌素（streptozocin, STZ）注射构建2型DCM大鼠动物模型，并进行以下研究：
（1）糖尿病状态下早期应用TMZ对心肌能量代谢的影响：测定血糖、血脂、胰岛素等血清学指标，检测心肌组织中的脂肪沉积，了解糖代谢、脂代谢情况；
（2）糖尿病状态下早期应用TMZ对心肌氧化应激的影响：分别检测心肌组织中氧化指标和抗氧化指标，分析心肌组织氧化应激程度；
（3）糖尿病状态下早期应用TMZ对心肌细胞凋亡的影响：检测心肌组织中心肌细胞的凋亡水平和凋亡相关调控分子的表达情况，以明确TMZ对心肌细胞凋亡的抑制作用及可能机制；
（4）早期应用TMZ对DCM大鼠模型心脏功能的影响：采用二维超声心动图技术、多普勒技术、心导管技术评价左室舒张和收缩功能，比较不同组别以及应用TMZ前后的心功能的变化。
研究方案
1.研究对象及方法：
（1）DCM动物模型的建立：选择健康成年雄性SD大鼠36只，体重200g±50g左右，随机分为3组：正常对照组（A组，12只）、DCM组（B组，12只）、DCM+TMZ组（C组，12只）。A组大鼠喂以基础饲料，主要组成为：20%粗蛋白，3%粗脂肪，3%粗纤维，其他74%（包括碳水化合物、微量元素等）。B组、C组大鼠喂以高糖高脂高热量饲料，主要成分为：25%±5%脂肪、10%蛋白质、50%±5%碳水化合物和其他成分。4周后B、C组大鼠给予一次性腹腔注射STZ50mg/kg，A组大鼠给予同等剂量枸橼酸钠缓冲液腹腔注射；各组大鼠以原饲料继续喂养1周后，测定空腹血糖和胰岛素，选空腹血糖大于正常大鼠血糖均值±3个标准差和胰岛素敏感性减低的大鼠纳入实验，各组以原饲料继续喂养，同时C组给予TMZ灌胃，每天20mg/kg，A组、B组大鼠给予等量生理盐水灌胃，每天上午给药，每周通过测量体重调整药物用量，共给药12周；
（2）超声心动图和血流动力学监测：应用超声心动图技术测量大鼠左室心肌重量指数、左室射血分数、左室舒张功能、心肌超声背向散射积分和其周期变化幅度；应用心导管技术测定其左室松弛时间常数，左室±dp/dtmax，左室舒张末压，左室收缩末压，以监测2型糖尿病动物心肌病变模型的建立及心功能的变化；
（3）空腹血糖（FBG）、胰岛素（FINS）和血脂（TG）的测定：分别于开始饲养后的4周末、5周末及实验结束测定FBG、FINS、TG，并计算1/FBG×FINS作为胰岛素抵抗指标；
（4）心肌中脂肪组织沉积的检测：油红O染色法测定心肌组织内中性脂质的沉积情况；
（5）心肌组织氧化应激指标的检测：①氧化指标：应用荧光探针染料测定心肌组织内ROS含量，采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛(MDA)含量；②抗氧化指标：采用黄嘌呤氧化酶法测定总超氧化物歧化酶(SOD)活性，Western blot法测定线粒体MnSOD、胞浆Cu/ZnSOD的表达情况。
（6）氧化应激下游事件的检测：①线粒体功能损害：对心肌细胞实行亚细胞分离，Western blot法分别测定线粒体和胞浆内细胞色素C的水平；②凋亡相关基因表达变化：采用实时定量RT-PCR和/或Western blot定量检测心肌组织中Bcl-2、Bax等的表达水平；
（7）心肌组织细胞凋亡的检测及凋亡细胞类型鉴定：心肌石蜡包埋组织切片心肌细胞凋亡采用原位缺口末端标记法（TUNEL法），应用免疫组织化学染色法定性观察，同时采用实时定量RT-PCR和/或Western blot定量检测心肌组织中caspase-3的表达水平。
3. 统计方法：
　　所有计量资料数据以均数±标准差表示，采用SPSS19．0统计软件进行统计学处理。不同组别间均数差别比较采用方差检验，并应用最小显著差法进一步比较两组间的差别，显著性检验水准均为α=0.05。
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