曲美他嗪对血管紧张素Ⅱ诱导心力衰竭的保护作用及机制
一、研究内容和预期成果摘要
曲美他嗪抑制心肌脂肪酸B氧化，增加葡萄糖氧化，有保护心肌细胞的作用。然而，曲美他嗪对心肌细胞自噬的影响尚未见报道，我们前期观察到：血管紧张素Ⅱ刺激引起心肌细胞自噬显著增多，而曲美他嗪可抑制血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞自噬。在曲美他嗪生物学作用机制中，有研究报道其对心功能的保护作用是通过p38和p-Akt信号通路。为此，本课题将构建血管紧张素Ⅱ诱导心力衰竭模型，以小动物心脏超声、Western Blot、实时定量PCR法从在体方面研究曲美他嗪对AngⅡ诱导心力衰竭的改善作用是否与抑制自噬有关；同时，培养心肌细胞，从离体方面研究曲美他嗪对心肌细胞自噬的影响；并应用液相芯片技术研究MAPK/ERK、p38、JNK、Akt信号通路蛋白变化，以观察曲美他嗪抑制细胞自噬可能的信号通路；最后应用信号通路蛋白抑制剂干预后观察细胞自噬的变化，从而明确曲美他嗪抑制细胞自噬的信号通路。本课题阐明曲美他嗪对血管紧张素Ⅱ诱导心力衰竭的保护作用及机制，为临床应用提供实验依据。
二、立题依据
心力衰竭是各类心血管疾病的主要转归,它正在成为本世纪最重要的心血管病症。虽然近十余年来心力衰竭药物治疗取得了重大进展, 但是心力衰竭患者的预后仍然很差，5年存活率与恶性肿瘤相仿。血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,AngⅡ）在心力衰竭的发展中起着重要的作用1, 2，AngⅡ可诱导小鼠发生心力衰竭3。近来有研究发现，用AngⅡ刺激培养的心肌细胞引起自噬增多4。然而该研究没有探讨AngⅡ引起的自噬对心功能的影响。因此，明确AngⅡ诱导的自噬在心力衰竭中的作用并寻找新的治疗药物已经成为心血管医师重要的研究课题。
【AngⅡ诱导小鼠心肌细胞自噬增多】
自噬是以胞质内出现双层膜结构包裹长寿命蛋白和细胞器的自噬体为特征的细胞“自我消化”的一系列生化过程，它是凋亡之外的第二种程序性细胞死亡方式5。自噬在心力衰竭的发生中起着重要的作用。申请者前期的研究显示：在压力超负荷诱导的心力衰竭小鼠心脏中，心肌细胞自噬明显增多。同样，在扩张型心肌病、高血压性心脏病、心肌局部缺血等病人发生心力衰竭时,濒死的心肌细胞表现出明显增强的自噬特征6-8。研究发现心力衰竭心脏中心肌细胞丢失的主要形式是自噬，远远超过凋亡6, 9-11。将单纯主动脉狭窄患者根据射血分数（ejection fraction ，EF）分为：EF>50%组；EF30%- 50%组；EF<30%组，检测各组心肌自噬和凋亡的发生率，EF>50%组心肌中自噬0.5‰、凋亡0.02‰；EF30%- 50%组心脏中：自噬1.05‰、凋亡0.01‰；EF<30%组心脏中：自噬6.05‰，没有发现凋亡9。另外有研究报道过度自噬引发的自噬性细胞死亡导致心力衰竭12, 13。申请者推测：当AngⅡ诱导的自噬性心肌细胞死亡数目达到一定程度时就可能引起心力衰竭。申请者通过预实验发现用AngⅡ刺激小鼠心肌细胞引起心肌细胞自噬显著增多。然而，临床上抑制心肌细胞自噬的药物尚不明确。
Western Blot检测LC3B水平。在体实验发现AngⅡ组LC3B较control组明显增多，提示AngⅡ诱导心肌细胞自噬。
【曲美他嗪抑制心肌细胞自噬】
曲美他嗪为哌嗪类衍生物，主要通过抑制3-酮酰辅酶A硫解酶而抑制心肌脂肪酸B氧化，增加葡萄糖氧化，改善糖酵解与糖氧化耦联，优化心肌细胞能量代谢。近年来，有研究发现曲美他嗪有改善心脏功能、减轻心力衰竭症状的作用14, 15。基础研究还证实，曲美他嗪能减少细胞内H+、Na+、Ca2+的超载，抑制氧自由基生成，对于维持心肌细胞的存活具有重要意义，具有抗凋亡作用16。然而，曲美他嗪对心肌细胞自噬的影响尚未见报道，申请者通过预实验从离体水平观察了曲美他嗪与AngⅡ诱导的细胞自噬的关系，发现曲美他嗪减少了AngⅡ诱导的心肌细胞自噬相关蛋白LC3B。由此，我们提出假说：曲美他嗪可能通过抑制心肌细胞自噬改善心功能，但其中涉及的相关信号通路需要进一步研究。
Western Blot检测LC3B水平。离体实验发现AngⅡ+ TMZ组LC3B较AngⅡ组明显降低，提示TMZ抑制了AngⅡ诱导的心肌细胞自噬。
【曲美他嗪抑制心肌细胞自噬可能的信号通路】
在曲美他嗪对心肌细胞作用的相关研究中，有报道显示：曲美他嗪对缺血再灌注的心肌有保护作用，可以改善心功能，该保护作用是通过p38和PI3K/Akt信号通路17。然而，在本课题中，曲美他嗪减少心肌细胞自噬的信号通路需要进一步研究、并加以验证。
【本课题的主要思路及临床意义】
本课题针对曲美他嗪抑制心肌细胞自噬这一全新作用展开研究方案的设计。首先从离体水平研究曲美他嗪对AngⅡ诱导心肌细胞自噬的影响；然后从在体实验观察曲美他嗪对AngⅡ诱导心力衰竭小鼠心肌细胞自噬及心功能的影响；应用液相芯片观察MAPK/ERK、JNK、 p38以及PI3K/Akt信号通路蛋白的变化；最后应用信号通路蛋白抑制剂干预后观察自噬的变化，从而明确曲美他嗪抑制心肌细胞自噬的机制。
本课题将阐明曲美他嗪对AngⅡ诱导心力衰竭的保护作用及机制，为临床应用曲美他嗪来治疗心力衰竭提供实验依据和理论支持。
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三、课题研究的总目标和特色、创新点，主要研究内容及所需要解决的技术难点
（1）研究目标：
他嗪对AngⅡ诱导心力衰竭的保护作用；
②探讨曲美他嗪对AngⅡ诱导心力衰竭保护作用的机制。
（2）研究内容：
①研究曲美他嗪对AngⅡ诱导心力衰竭的改善作用
通过埋置含AngⅡ的渗透压泵，持续释放4周建立了小鼠心力衰竭模型，经另一个渗透压泵给予曲美他嗪干预后，以小动物心脏超声检测心功能变化。
②研究曲美他嗪对AngⅡ诱导心力衰竭的改善作用是否与抑制自噬有关
通过埋置含AngⅡ的渗透压泵，持续释放4周建立了小鼠心力衰竭模型，经另一个渗透压泵给予曲美他嗪干预后，Western Blot和定量PCR检测心肌细胞自噬相关蛋白及基因的变化，观察曲美他嗪对心肌细胞自噬的影响。同时，通过培养心肌细胞从离体水平研究曲美他嗪对AngⅡ诱导心肌细胞自噬的影响。
③研究曲美他嗪减少AngⅡ诱导心肌细胞自噬的机制
应用液相芯片研究MAPK/ERK、JNK、 p38以及PI3K/Akt信号通路蛋白变化，从而观察曲美他嗪抑制细胞自噬可能的信号通路；应用信号通路蛋白抑制剂干预后观察自噬相关蛋白和基因的变化，从而阐明曲美他嗪抑制心肌细胞自噬的信号通路。
（3）研究方案：
第一部分：研究曲美他嗪对AngⅡ诱导心力衰竭的保护作用
1.实验模型建立及干预：
C57BL/6小鼠8周龄时埋置含PBS、AngⅡ（1.46mg/kg/day，Sigma-Aldrich）、曲美他嗪（3.6mg/kg/day）的透压泵，持续释放4周。
2.实验分组：每组5只小鼠，随机分组如下：
① Vehicle组；
② AngⅡ组；
③ AngⅡ +曲美他嗪组；
④ 曲美他嗪组。
3. 对以上各组进行心力衰竭相关指标的检测：
①小鼠心脏超声（埋泵前、埋泵后4周）；
②心重/体重比值（埋泵后4周）；
③小鼠心肌病理切片观察心肌细胞直径（埋泵后4周）。
第二部分：研究曲美他嗪对心肌细胞自噬的影响
第一节:在体水平研究曲美他嗪对AngⅡ诱导心肌细胞自噬的影响
1.实验模型建立及干预：
C57BL/6小鼠8周龄时埋置含PBS、AngⅡ（1.46mg/kg/day，Sigma-Aldrich）、曲美他嗪（3.6mg/kg/day）的渗透压泵，持续释放4周。
2. 实验分组：每组5只小鼠，随机分组如下：
① Vehicle组；
② AngⅡ组；
③ AngⅡ + 曲美他嗪组；
④ 曲美他嗪组。
3. 对以上各组进行自噬指标的检测：
①Western blot检测：LC3B、Beclin1；
②Real time-PCR检测：LC3B、Beclin1。
第二节:离体水平研究曲美他嗪对AngⅡ诱导心肌细胞自噬的影响
1. 心肌细胞的分离培养及分组：
1.1 新生C57BL/6小鼠心肌细胞原代培养。干预的药物及剂量：曲美他嗪(100 umol/l)、AngⅡ(1umol/l)。
1.2 心肌细胞原代培养48h后换无血清培养基，24小时后按照如下分组进行后续实验：
①Vehicle组；
②AngⅡ组；
③AngⅡ + 曲美他嗪组；
④曲美他嗪组。
2.检测指标：
干预48小时后对以上各组进行自噬相关指标检测：
①Western blot检测：LC3B、Beclin1
<②Real time-PCR检测：LC3B、Beclin1。
第三部分:探讨曲美他嗪抑制AngⅡ诱导心肌细胞自噬可能的信号通路
1.应用液相芯片筛选曲美他嗪抑制AngⅡ诱导心肌细胞自噬的信号通路：
在第二部分第二节分组干预的基础上提取蛋白，应用Bio-Plex液相芯片观察MAPK/ERK、JNK、 p38以及PI3K/Akt信号通路蛋白的变化。
2.信号通路调控作用的验证：
2.1根据液相芯片结果确定曲美他嗪抑制细胞自噬可能的信号通路，应用信号通路蛋白抑制剂进行下一步的验证。
2.2 实验分组：
①Vehicle组；
②AngⅡ组
③AngⅡ + 曲美他嗪组；
④曲美他嗪组。
<⑤Inhibitor组；
⑥Inhibitor + AngⅡ +曲美他嗪组
2.3对以上各组进行自噬指标的检测：
①Western blot检测：LC3B、Beclin1；
②Real time-PCR检测：LC3B、Beclin1。
（4）技术路线：
第一部分路线图：曲美他嗪的保护作用观察
第二部分路线图：信号通路研究
（5）创新点：细胞自噬是近年来基础研究的热点，既往针对细胞自噬的研究多采用基因敲除小鼠或转基因小鼠。然而，基因治疗离临床应用还有很长的路要走。本研究从曲美他嗪抑制心力衰竭的心肌细胞自噬角度进行，为临床实际运用提供实验依据和理论支持。
（6）技术难点：
液相芯片技术、小鼠心脏超声均为本课题的技术难点，本课题负责人已熟练掌握。