曲美他嗪通过抑制心肌细胞内质网应激防治慢性心力衰竭
立题依据
　　心力衰竭是是各种病因所致心脏病的终末阶段。其主要病理生理问题是原发性心肌损害或心肌收缩期或舒张期负荷过重导致心肌细胞数量减少和心室舒缩功能低下并伴有肾上腺素受体持久激活以及肾素-血管紧张素-醛固酮系统过度兴奋等，最终导致心肌细胞凋亡、细胞外基质重塑。目前，尽管以β受体阻滞剂、血管紧张素酶抑制剂以及螺内酯为主的药物干预能够延缓病人的寿命及降低死亡率，但是绝大部分患者仍然无法控制病情的持续发展而走向终末期心力衰竭，因此目前亟待发现新的有效的治疗方法。
1. 内质网应激反应在人心力衰竭和心力衰竭动物模型心脏中激活
　　近年来，研究发现内质网应激反应通路是一种新的信号传导机制，在心力衰竭中起到重要作用。内质网是真核细胞脂类合成、蛋白质折叠和成熟的中心，也是维持细胞稳态的主要信号传导细胞器﹝1﹞。内质网对影响细胞内能量水平、氧化状态或Ca2+浓度的应激相当敏感，当细胞受到某些打击（如缺氧、药物毒性等）后，内质网腔内大量未折叠蛋白质聚集，诱发内质网应激（ER stress）〔2，3〕。内质网应激是细胞受刺激后的最初反应，是线粒体氧化应激等细胞应激反应的共同初始通路，是细胞的一种保护性反应，通过三个内质网跨膜感受蛋白PERK、ATF6和IRE1介导，减少错误折叠蛋白的蓄积，恢复内质网的正常功能，但若应激持续，内质网应激相关的凋亡途径被激活，促进细胞凋亡〔4。5〕。
　　大量证据表明，内质网应激在许多疾病，如糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化、癌症、神经变性疾病等中起重要作用〔2，6－8〕。内质网应激反应与众多导致心力衰竭的心血管疾病如动脉粥样硬化、心肌缺血、心肌肥大等密切相关〔9－11〕。我们前期的研究在人心力衰竭标本和两种模拟人心肌肥大心力衰竭的小鼠模型中，发现心肌细胞内质网分子伴侣表达明显升高，内质网相关的细胞凋亡增加。
因此，去除诱发内质网应激的因素、阻断内质网应激持续所致凋亡通路的关键环节，成为治疗心力衰竭的新方向。
2. 钙离子稳态失衡是内质网应激诱发和持续的重要因
 钙离子的储存和信号传导是哺乳动物内质网的主要功能之一，钙离子稳态失衡可导致细胞凋亡。心肌细胞内质网（肌浆网）膜上，斯里兰卡肉桂碱受体（RyR2）是将Ca2+释放出肌浆网的通道，Ca2+-ATP酶2a（SERCA2a）主要负责将Ca2+泵入肌浆网，在心力衰竭的心脏中，RyR2过磷酸化且SERCA2a的表达和活性下降，导致Ca2+从肌浆网释放增多而泵入减少，从而引起肌浆网钙库清空，细胞内钙超载〔12〕。最近研究揭示，内质网钙泵受损、干扰细胞钙库Ca2+的浓度、胞内Ca2+超载或内质网钙库清空都能触发内质网应激反应以致细胞凋亡〔13〕。我们前期的研究证明，在心力衰竭的动物模型中，Ca2+依赖的钙调蛋白激酶II（CaMKII）被激活，表明胞内Ca2+浓度增加。因此，通过恢复肌浆网钙泵的功能和活性，减少胞内Ca2+超载，维持Ca2+稳态，能抑制内质网应激的激活和持续，减少心肌细胞凋亡，是潜在的治疗心力衰竭新的靶点。
3.  曲美他嗪可减轻心肌细胞内钙超载，抑制内质网应激，减少心肌细胞凋亡
　　曲美他嗪已被证实能够通过调控代谢途径，作为抗心肌缺血或细胞保护剂，有效的治疗慢性稳定型心绞痛和左心室功能障碍〔14〕。曲美他嗪能够抑制长链3-酮酰辅酶A硫解酶(3-KAT)在心肌细胞中的β-氧化途径，发挥其关键的药理作用〔15〕。这将使得心脏代谢由游离脂肪酸氧化转为葡萄糖氧化，而后者是一种在耗氧量和能量（三磷酸腺苷）生产方面更有效的代谢途径。有研究证实，曲美他嗪可缓解心肌功能障碍，因为它能够增加葡萄糖和乳酸的利用率，减少心肌氧消耗总量的16-26%〔16〕。
曲美他嗪还能提供代谢性心肌细胞保护作用，主要是通过减少细胞内H+、Ca2+、Na+的超载。于是，我们提出假设：曲美他嗪通过减轻细胞内钙超载，抑制内质网应激，减少心肌细胞凋亡，从而保护心肌，防治慢性心力衰竭。
主要参考文献
1.Lin JH, Walter P, Yen TS. Endoplasmic reticulum stress in disease pathogenesis. Annu Rev Pathol. 2008;3:399-425
2.Marciniak SJ, Ron D. Endoplasmic reticulum stress signaling in disease. Physiol Rev. 2006;86:1133-1149
3.Xu C, Bailly-Maitre B, Reed JC. Endoplasmic reticulum stress: Cell life and death decisions. J Clin Invest. 2005;115:2656-2664
4.Kaufman RJ. Orchestrating the unfolded protein response in health and disease. J Clin Invest. 2002;110:1389-1398
5.Mori K. Tripartite management of unfolded proteins in the endoplasmic reticulum. Cell. 2000;101:451-454
6Lindholm D, Wootz H, Korhonen L. Er stress and neurodegenerative diseases. Cell Death Differ. 2006;13:385-392
7.Ozcan U, Cao Q, Yilmaz E, Lee AH, Iwakoshi NN, Ozdelen E, Tuncman G, Gorgun C, Glimcher LH, Hotamisligil GS. Endoplasmic reticulum stress links obesity, insulin action, and type 2 diabetes. Science. 2004;306:457-461
8.Wellen KE, Hotamisligil GS. Inflammation, stress, and diabetes. J Clin Invest. 2005;115:1111-1119
9.Myoishi M, Hao H, Minamino T, Watanabe K, Nishihira K, Hatakeyama K, Asada Y, Okada K, Ishibashi-Ueda H, Gabbiani G, Bochaton-Piallat ML, Mochizuki N, Kitakaze M. Increased endoplasmic reticulum stress in atherosclerotic plaques associated with acute coronary syndrome. Circulation. 2007;116:1226-1233
10.Okada K, Minamino T, Tsukamoto Y, Liao Y, Tsukamoto O, Takashima S, Hirata A, Fujita M, Nagamachi Y, Nakatani T, Yutani C, Ozawa K, Ogawa S, Tomoike H, Hori M, Kitakaze M. Prolonged endoplasmic reticulum stress in hypertrophic and failing heart after aortic constriction: Possible contribution of endoplasmic reticulum stress to cardiac myocyte apoptosis. Circulation. 2004;110:705-712
11.Szegezdi E, Duffy A, O'Mahoney ME, Logue SE, Mylotte LA, O'Brien T, Samali A. Er stress contributes to ischemia-induced cardiomyocyte apoptosis. Biochem Biophys Res Commun. 2006;349:1406-1411
12.Dibb KM, Graham HK, Venetucci LA, Eisner DA, Trafford AW. Analysis of cellular calcium fluxes in cardiac muscle to understand calcium homeostasis in the heart. Cell Calcium. 2007;42:503-512
13.Orrenius S, Zhivotovsky B, Nicotera P. Regulation of cell death: The calcium-apoptosis link. Nat Rev Mol Cell Biol. 2003;4:552-565
14.Liu F, Yin L, Zhang L, Liu W, Liu J, Wang Y, Yu B. Trimetazidine improves right ventricular function by increasing mir-21 expression. Int J Mol Med. 2012;30:849-855
15.Kantor PF, Lucien A, Kozak R, Lopaschuk GD. The antianginal drug trimetazidine shifts cardiac energy metabolism from fatty acid oxidation to glucose oxidation by inhibiting mitochondrial long-chain 3-ketoacyl coenzyme a thiolase. Circ Res. 2000;86:580-588
16.Lopaschuk GD, Stanley WC. Glucose metabolism in the ischemic heart. Circulation. 1997;95:313-315
三、研究目标与研究内容
研究目标：
　　本研究旨在揭示曲美他嗪减轻心肌细胞内Ca2+ +超载，调控慢性心衰中钙超载引发的内质网应激，阐释慢性心衰模型中病理生理机制的重要分子基础，并提供新的治疗靶点及方案。为此我们确定了2个具体的研究目标：
    1. 确证曲美他嗪对慢性心衰的治疗作用；
    2. 确证曲美他嗪对慢性心衰中心肌内质网应激的调控作用。
研究内容：
　　近年来我们和其他一些研究小组在不同的心力衰竭动物模型中均发现内质网应激反应及其相关凋亡通路被激活，而阻断内质网应激反应持续、恢复内质网功能成为心力衰竭潜在的治疗靶点。大量研究显示曲美他嗪能恢复细胞钙离子稳态，保护心血管系统。本项目将在体内和体外证实曲美他嗪对内质网应激的影响，以期发现心力衰竭新的、安全有效的防治方法。我们将从以下几方面研究实现本项目的目标：
    1．在普通C57BL/6小鼠皮下植入异丙肾上腺素（Iso，30mg/kg/d，14天）渗透性微泵，建立慢性心力衰竭模型，给予曲美他嗪、β受体阻断剂或二者联合干预，了解曲美他嗪能否改善小鼠心功能和血流动力学参数，研究曲美他嗪对内质网应激和内质网相关细胞凋亡的影响，明确其对心力衰竭的预防作用。
2．通过心肌细胞系和乳鼠原代细胞体外培养方法，进一步研究曲美他嗪对抗内质网应激和内质网相关细胞凋亡的分子机制，明确曲美他嗪对维持钙离子稳态和恢复内质网功能的作用机制。
总之，通过本项目的研究将阐明曲美他嗪在心力衰竭中抑制内质网应激的作用及机理，这将对认识心力衰竭的发生发展提供新的理论基础，为下一步研究心力衰竭的治疗提供新的策略。
四、研究方案（包括研究对象、研究方法、技术路线、统计方法等）
1. 动物模型建立：
1）普通C57BL/6小鼠皮下植入异丙肾上腺素（Iso，30mg/kg/d，14天）渗透性微泵，建立心力衰竭模型
2）动物分组：control组（空白对照）、Iso组、Iso+曲美他嗪组（20mg/kg/d，灌胃）、Iso+美托洛尔组（30mg/kg/d，灌胃）、Iso+美托洛尔+曲美他嗪组
3）在上述动物模型中应用高频超声和Millar导管系统检测动物心脏功能，研究曲美他嗪对心肌肥大心力衰竭的心脏收缩和舒张功能的保护作用，具体操作步骤如下：
高频超声检测实验动物心脏功能：小鼠麻醉后，剪掉心前区毛发，应用心脏超声检测心脏血流动力学指标，经相关软件分析后计算出下列指标：包括左室舒张期内径（Left Ventricular Internal Dimension， diastole，LVIDd）、左室收缩期内径（Left Ventricular Internal Dimension，systole，LVIDs）、左室后壁舒张期厚度（Left Ventricular Posterior Wall，diastole，LVPWd）、左室后壁收缩期厚度（Left Ventricular Posterior Wall，systole， LVPWs）、左室前壁舒张期厚度（Left Ventricular Anterior Wall，systole，LVAWd）、左室前壁收缩期厚度（Left Ventricular Anterior Wall，systole，LVAWs）、射血分数(Ejection Fraction，EF%)以及缩短分数（Fractional Shortening，FS%）等。
Millar导管系统检测实验动物心脏功能：a. 小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（40mg/kg）麻醉，固定于小动物手术台；b. 颈部正中剪一长约2cm的竖形切口，钝性分离各层组织，暴露右颈总动脉鞘后，小心游离约1cm长的颈动脉；c. 结扎颈动脉远心端，动脉夹夹闭近心端；d. 在远心端作一斜形向心切口，将前端带有电极的P-V微导管（SPR-838, Millar Instruments, Houston, TX）经右颈总动脉插入至主动脉，导管通过压力-容积传导系统（Millar instruments）连接PowerLab/4SP A/D 转换器与MS-302多媒体生物信号采集分析系统连接，动态观察压力波形变化，稳定数分钟后记录动脉波形；e. 将导管缓慢向左心室送入，根据监视仪上显示的波形变化，直至出现较好的压力-容积环图形，确认导管进入左心室后固定导管；f. 小鼠稳定20分钟，连续记录压力、容积变化，以获得稳态的血流动力学数据；g. 血流动力学数据经压力-容积分析软件（PVAN）处理后获得，观察指标包括心率（HR）, 左室收缩末压（LV end-systolic pressure, LVESP），左室舒张末压（LV end-diastolic pressure, LVEDP），左室压力最大上升和下降速率（±dP/dt max）。
①在上述动物模型中，实验终点取动物心脏标本，测量心脏体重比值评估小鼠心肌肥大程度，用组织学方法观察心肌组织形态、细胞大小，研究曲美他嗪对心肌肥大的改善作用。
②在上述动物模型中，用免疫组织化学方法检测心肌内质网应激相关标志物（KDEL、CHOP、XBP1等）的表达情况，Western Blots、实时荧光定量PCR方法检测内质网应激反应三条通路（PERK-eIF2α-ATF4，ATF6-cleved ATF6，IRE1α-spliced XBP1）相关基因和蛋白表达，来研究曲美他嗪对心肌细胞内质网应激的抑制作用。
③心肌细胞凋亡的检测：在上述动物模型中，用TUNEL方法检测心肌细胞凋亡，Western Blots检测内质网应激特异性凋亡蛋白（CHOP、Caspase12）和共同凋亡通路相关蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、Bax、JNK通路相关蛋白等）表达，研究曲美他嗪对心肌细胞凋亡的抑制作用。
2. 体外检测指标：
1）细胞培养：采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养H9c2心肌细胞系。原代心肌细胞培养：无菌条件下开胸取出SD乳鼠（1-3d）心脏，剪碎1-3mm3大小，以0.08%胰蛋白酶消化5min左右，10%胎牛血清培养基终止消化，反复数次，直至碎片完全消化。将细胞以培养基悬浮，收集于培养瓶中，差速贴壁60min后，吸取未贴壁细胞至新培养瓶中。心肌细胞培养48h后，加入0.1mmol/L的5-BrdU，以抑制非心肌细胞的生长。镜下观察细胞跳动及免疫组化α-actin鉴定心肌细胞。
2）细胞分组：control、Iso、Iso+曲美他嗪、Iso+曲美他嗪+美托洛尔、Iso +美托洛尔。
3）细胞损伤检测指标：
TUNEL试剂盒（Roche，USA）检测细胞凋亡；Annexin V/PI双染试剂盒（南京凯基）检测细胞凋亡；ELISA试剂盒检测Caspase12活性。
4）内质网应激检测指标：
Western Blots、实时荧光定量PCR方法检测内质网应激反应三条通路（PERK-eIF2α-ATF4，ATF6-cleved ATF6，IRE1α-spliced XBP1）相关基因和蛋白表达，来研究曲美他嗪对心肌内质网应激的抑制作用。
5）心肌细胞凋亡的检测：用流式细胞学方法检测心肌细胞凋亡，Western Blots检测内质网应激特异性凋亡蛋白（CHOP、Caspase12）和共同凋亡通路相关蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、Bax、JNK通路相关蛋白等）表达，研究曲美他嗪对心肌细胞凋亡的抑制作用。
6）检测细胞内Ca2+浓度、Ca2+清除率、SERCA表达及活性、CaMKII表达及活性等与细胞钙离子稳态、促发内质网应激密切相关的指标；其中，胞内Ca2+浓度使用Fluo-4 NW试剂盒（Invitrogen）、CaMKII活性使用Elisa试剂盒检测；用Western Blots检测SERCA、CaMKII表达；
钙离子清除率和SERCA动态功能测定：
　　钙离子清除率测定是按照Ma R所述的方法指导下进行的。培养的细胞用胰酶消化再离心收集，每次约需1X106 个细胞。细胞用含有140mM氯化钠、5mM氯化钾、1.8mM氯化钙、10mM葡萄糖、0.1%BSA、15mMhepes，PH值为7.4重悬后的ECS缓冲液洗涤，再用含有0.05%Pluronic F-127的浓度为2μM的indo-1/AM标记细胞，此混合物在室温下震摇45min。Indo-1/AM标记的细胞用不含氯化钙的ECS缓冲液洗涤三遍。然后用含有10μM无钙EGTA的ESC/EGTA缓冲液重悬。取2ml indo-1/AM标记的细胞用于钙离子比率测定。在30秒平衡后，向细胞悬液中滴加10μM Ionomycin，以用来促进钙离子从内质网钙池中释放。钙离子清除率是通过带有350nm激发光和405和485nm发射光单色仪的PDI荧光分光光度计测的胞内游离钙离子浓度来表示的。内质网内相对钙离子储存量，曲线变化程度，胞浆内钙离子浓度回归基础水平的时间都可以得到相应的分析。
唐家荣