曲美他嗪对老年缺血性心脏病患者体内Th17/Treg平衡的影响研究
立论依据
　　缺血性心脏病（ischemic heart disease,IHD）是冠状动脉粥样硬化引起管腔狭窄或闭塞，导致心肌缺血缺氧甚至坏死而引起的一种常见心脏病，年龄是其主要危险因素之一，老年人是该病的高发人群。杨功焕（1）等对2010年全球疾病负担、伤害及危险因素研究（GBD2010）中我国数据进行分析后发现，1990-2010年中国疾病谱发生快速转变，IHD已成为我国目前占主导地位的疾病负担之一，排名从第七位上升至第二位。IHD是动脉粥样硬化 （atherosclerosis，AS）导致器官病变的最常见类型。
　　AS是一种慢性炎症性疾病（2），适应性免疫在AS发病过程中具有重要作用，T淋巴细胞是介导适应性免疫的核心组成。AS斑块中存在不同类型T细胞亚群，其中，白介素-17产生性辅助T细胞（interleukin 17-producing helper T cell，Th17）发挥促AS效应，诱导并加重斑块局部炎症；而在免疫系统中发挥调节功能的调节性T细胞（regulatory T-cell，Treg）也存于AS斑块中，此类细胞拥有免疫抑制和维持自身免疫耐受的能力，但它们在AS发病过程中数量减少且功能下降（3）。免疫炎症与免疫调节间的不平衡促进了AS形成和发展。
　　Th17细胞是近期明确的一群独特Th细胞亚群，表达特异性转录因子RORγt （4）。Th17细胞通过分泌IL-17发挥强烈促炎作用（5）。在AS及AS导致的器官病变如IHD特别是急性冠脉综合征（acute coronary syndrome,ACS）中，炎症反应伴随着Th17细胞亚群的显著增加和IL-17水平的显著升高（6），且这种趋势与血管疾病的严重程度和进展相关（7）。
　　Treg是免疫系统中发挥调节功能的主要细胞，拥有免疫抑制和维持自身免疫耐受的能力（8）,叉头基因转录因子Foxp3对其发育和功能至关重要，是该群细胞特异性标志物（9）。Treg通过直接细胞接触或分泌抑制性细胞因子（如IL-10、TGF-β）等机制抑制效应性免疫细胞或自身反应性免疫细胞的活化增殖。Treg在AS进程中起着重要免疫负调控作用，能抑制各种免疫细胞的增殖和功能，包括CD4+和CD8+T细胞、单核/巨噬细胞及DC等（10）。临床研究发现，ACS患者体内的Treg数量和功能下调（11），提示Treg数量和功能下调打破了自身免疫耐受，导致机体发生病理性自身免疫应答，参与了AS进程。
　　在AS及其血管并发症的研究中，均发现Th17/Treg比例或功能失衡。IHD患者的相关研究报道了Th17/Treg失衡与下述因素相关，外周Th17细胞数量、Th17细胞相关的细胞因子（IL-17和IL-6）及转录因子（RORγt）水平显著增加，而Treg细胞数量、Treg相关的细胞因子（IL-10和TGF-β1）及转录因子（Foxp3）水平明显减少（12, 13）。因此，恢复Th17/Treg平衡可能是一个有前景的治疗AS及其常见器官病变如IHD的策略方法。
　　曲美他嗪(Trimetazidine,TMZ) 的化学名称为1－( 2，3，4－三甲基苯唑)－双氢盐酸哌嗪，是哌嗪类衍生物，主要通过优化心肌能量代谢而改善心肌缺血，作用机制是选择性抑制脂肪酸代谢途径中的一种关键酶--长链3-酮酰辅酶A硫解酶（3-KAT），从而使心肌能量代谢从脂肪酸途径向葡萄糖途径迁移，利用有限氧产生更多ATP，提高运动耐量（14）。近年来研究发现TMZ在抑制炎症反应中也发挥重要作用。研究表明，ACS患者经皮冠脉介入治疗（PCI）前给予TMZ能减少围术期心肌损伤，该效应与TMZ抑制高敏C反应蛋白（hs-CRP）水平升高，减轻炎性反应有关（15，16）。还有研究显示，TMZ可通过降低白介素-6（IL-6）水平而减轻冠脉搭桥术（CABG）所致炎症反应（17）。动物实验亦提示，TMZ对吸烟诱导大鼠左室重构发挥保护作用与减少炎症因子IL-6、白介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达相关（18）。在人类中，IL-1β和IL-6诱导初始CD4+T细胞向Th17分化，而TGF-β1可抑制这种分化倾向（19, 20）。IHD相关研究证实，ACS患者外周血Th17/Treg比例失衡的原因与IL-6-STAT3信号活化诱导Th17细胞分化增加相关（21）。因此，我们有理由相信TMZ可能在抑制IL-6、IL-1β等多种炎症因子的基础上影响IHD患者体内Th17/Treg比例或功能平衡，目前尚未见有这方面的研究报道。
　　综上所述，我们以老年IHD患者作为研究对象，探讨TMZ是否通过影响患者体内Th17/Treg比例或功能平衡而发挥治疗作用。为了验证这一假说，我们将通过人外周血来源Th17和Treg细胞，采用密度梯度离心、多色荧光流式细胞术、酶联免疫吸附测定法等手段，从分子、细胞、组织、人体等不同水平来探讨TMZ对老年IHD患者体内Th17/Treg比例或功能平衡的影响。本研究为TMZ治疗老年IHD的作用机制提供新思路。
参考文献：
1.Yang G, Wang Y, Zeng Y, et al. Rapid health transition in China, 1990-2010: findings from the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 2013;381(9882): 1987–2015.
2.Hansson GK. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease. The New England journal of medicine. 2005;352(16):1685-95.
3.Ketelhuth DF, Hansson GK. Cellular immunity, low-density lipoprotein and atherosclerosis: break of tolerance in the artery wall. Thrombosis and haemostasis. 2011;106(5):779-86.
4.Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, et al. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages. Nature immunology. 2005;6(11):1123-32.
5.Park H, Li Z, Yang XO, et al. A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17. Nature immunology. 2005;6(11):1133
-41.
6.Wang Z, Lee J, Zhang Y, et al. Increased Th17 cells in coronary artery disease are associated with neutrophilic inflammation. Scandinavian cardiovascular journal. 2011;45(1):54-61.
7.Liu Z, Lu F, Pan H, et al. Correlation of peripheral Th17 cells and Th17-associated cytokines to the severity of carotid artery plaque and its clinical implication. Atherosclerosis. 2012;221(1):232-41.
8.Peterson RA. Regulatory T-cells: diverse phenotypes integral to immune homeostasis and suppression. Toxicologic pathology. 2012;40(2):186-204.
9.Zorn E, Nelson EA, Mohseni M, et al. IL-2 regulates FOXP3 expression in human CD4+CD25+ regulatory T cells through a STAT-dependent mechanism and induces the expansion of these cells in vivo. Blood. 2006;108(5):1571-9.
10.Sasaki N, Yamashita T, Takeda M, et al. Regulatory T cells in atherogenesis. Journal of atherosclerosis and thrombosis. 2012;19(6):503-15.
11.Mor A, Luboshits G, Planer D, et al. Altered status of CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with acute coronary syndromes[J]. Eur Heart J. 2006;27(21):2530
-7.
12.Cheng X, Yu X, Ding YJ, et al. The Th17/Treg imbalance in patients with acute coronary syndrome. Clin Immunol 2008;127(1):89-97.
13.Li N, Bian H, Zhang J, Li X, Ji X, Zhang Y. The Th17/Treg imbalance exists in patients with heart failure with normal ejection fraction and heart failure with reduced ejection fraction. Clin Chim Acta 2010;411(23-24):1963-8.
14.Fragasso G, Perseghi, G, De Cobelli F, et al. Effects of metabolic modulation by trimetazidine on left ventricular function and phosphocreatine/adenosine triphosphate ratio in patients with heart failure. Eur Heart J. 2006;27(8):942-8.
15.Labrou A，Giannoglou G，Zioutas D，et al. Trimetazidine administration minimizes myocardial damage and improves left ventricular function after percutaneous coronary intervention. Am J Cardiovasc Drugs. 2007;7(2):143-50．
16.Faure JP，Baumert H，Han ZQ，et al．Evidence for a protective role of trimetazidine during cold ischemia: targeting inflammation and nephron mass. Biochem Pharmacol. 2003;66(11):2241-50．
17.Martins GF, Siqueira Filho AG, Santos JB, et al. Trimetazidine and inflammatory response in coronary artery bypass grafting. Arq Bras Cardiol. 2012;99(2):688-96.
18.Zhou X, Li C, Xu W, et al. Trimetazidine Protects against Smoking-Induced Left Ventricular Remodeling via Attenuating Oxidative Stress,Apoptosis, and Inflammation. PLoS ONE. 2012;7(7):e40424.
19.Acosta-Rodriguez EV, Napolitani G, Lanzavecchia A, et al. Interleukins 1beta and 6 but not transforming growth factor-beta are essential for the differentiation of interleukin 17-producing human T helper cells. Nat Immunol. 2007; 8(9):942-9.  
20.Wilson NJ, Boniface K, Chan JR, et al. Development, cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T cells. Nat Immunol. 2007;8(9):950-7.
21.Ma Y, Yuan X, Deng L, et al. Imbalanced Frequencies of Th17 and Treg Cells in Acute Coronary Syndromes Are Mediated by IL-6-STAT3 Signaling. PLoS ONE. 2013;8(8): e72804.
研究内容及研究方案
1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题
研究目标：
以老年IHD患者作为研究对象，探讨TMZ是否通过影响患者体内Th17/Treg比例或功能平衡而发挥治疗作用。为了验证这一假说，我们将通过人外周血来源Th17和Treg细胞，采用多色荧光流式细胞术、酶联免疫吸附测定、 蛋白质印迹等手段，从分子、细胞、组织、人体等不同水平来探讨曲美他嗪对老年IHD患者体内Th17/Treg比例或功能平衡的影响。本研究为曲美他嗪治疗老年IHD的作用机制提供新思路。
研究内容：
1)老年IHD患者体内Th17/Treg平衡情况：以年龄60岁以上老年人群为研究对象，以老年健康志愿者（Health Donor，HD）作为对照，诊断老年IHD的主要依据为冠脉造影提示冠脉的一个或多个分支存在至少50％的管腔狭窄，并进一步按临床证据将IHD分为两组，一组为稳定型心绞痛（stable angina pectoris，SAP），另一组为ACS。抽取上述三组人群（HD，SAP和ACS）外周血，分析其中Th17和Treg细胞占CD4+T淋巴细胞的比例，并检测Th17相关细胞因子（IL-17、IL-6和IL-1β）与转录因子（RORγt）水平，以及Treg相关细胞因子（TGF-β1和IL-10）与转录因子（Foxp3）水平，明确各组人群外周血Th17/Treg是否存在比例或功能失衡。
2)TMZ对老年IHD患者体内Th17/Treg平衡的影响：对于诊断为IHD的老年患者在常规治疗基础上加用TMZ治疗，并以仅常规治疗的老年IHD患者作为对照，比较治疗前后上述各项检测指标有否发生改变，明确TMZ是否通过影响老年IHD患者体内Th17/Treg平衡而发挥治疗作用。
拟解决的关键问题：
1)明确老年IHD患者的正确分组，明确SAP和ACS的准确纳入标准和排除标准，这对于本研究后续的实验结果至关重要。本课题组所在科室为老年医学科，拥有多名临床经验丰富的老年心血管疾病专家，可对老年IHD的诊断治疗提供正确规范的指导方案。
2)Th17和Treg细胞亚群鉴定及其相关细胞因子检测都需要使用多色荧光流式细胞术，因此该技术的熟练运用和流式结果的正确分析对本研究也十分关键。本课题组所在科研中心配备BD FACSCanto II流式细胞仪，拥有多名长期操作和分析流式的专业技术人员，可对实验结果的可靠性提供有力保障。
2.拟采取的研究方案、技术路线及可行性分析、统计学方法
研究方案：
1)明确研究对象并合理分组：以年龄60岁以上老年人群为研究对象，诊断老年IHD的主要依据为冠脉造影提示冠脉的一个或多个分支存在至少50％的管腔狭窄，并进一步按临床证据将IHD分为两组，一组为SAP，另一组为ACS，同时以老年健康志愿者（HD）作为对照。
2)分析HD、SAP和ACS三组人群外周血中Th17和Treg细胞占CD4+T淋巴细胞的
比例：抽取上述三组人群外周血，密度梯度离心法分离单个核细胞，多色荧光流式细胞术分析Th17（CD4+IL-17+RORγt+T细胞）和Treg（CD4+CD25+Foxp3+T细胞）占CD4+T淋巴细胞的比例并比较各组差异。
3)分析HD、SAP和ACS三组人群外周血中Th17和Treg相关细胞因子水平：抽取上述三组人群外周血，离心获取上层血清，酶联免疫吸附测定法检测其中 IL-17、IL-6、IL-1β、TGF-β1和IL-10等细胞因子水平并比较各组差异。
4)明确TMZ对老年IHD患者体内Th17/Treg平衡的影响：给予SAP和ACS组常规治疗基础上加用TMZ治疗1月后，并以仅常规治疗的患者作为对照，通过上述指标检测比较治疗前后Th17/Treg平衡变化。
技术路线：
1)老年IHD患者体内Th17/Treg平衡情况：

2)TMZ对老年IHD患者体内Th17/Treg平衡的影响：

可行性分析：
1)理论依据充分：IHD是AS导致器官病变的最常见类型。年龄是IHD主要危险因素之一，老年人是其高发人群。AS是一种慢性炎症性疾病，T淋巴细胞参与了该病发生发展，免疫炎症（Th17）与免疫调节（Treg）间的不平衡促进了AS形成和发展。TMZ是早期用于临床治疗IHD的代谢药物之一，主要通过优化心肌能量代谢而改善心肌缺血，近年来研究发现TMZ在抑制炎症反应中也发挥重要作用。因此，TMZ也可能通过影响老年IHD患者体内Th17/Treg平衡而发挥抗炎治疗作用。本项目科学依据充分，理论上可行。
2)研究目标切实：本项目研究目标的选择建立在我们以往研究经验和对相关领域大量文献分析和推理的基础上，具有充分立论依据，确保了研究目标切实可行。
3)研究基础扎实：本研究小组多年来主要从事IHD研究工作，具有较深厚的研
究背景，为实施本项目奠定了良好的基础。
4)相关实验技术成熟：本项目所涉及的实验方法如密度梯度离心法、多色荧光流式细胞术、酶联免疫吸附测定法等均是很成熟的技术。
5)团队结构合理：课题组成员结构合理，涵盖了本项目所需的各学科人才。
统计学方法：
用SPSS17. 0统计软件进行分析。所有数据以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析(ANOVA) ，治疗前后比较采用配对t检验，两组间比较采用成组t检验，相关性分析采用 Spearman相关系数。P<0. 05为有显著性统计学差异。
3.研究计划及预期研究成果
研究计划：
2015.1～2015.6  
　　在明确分组基础上，分析HD、SAP和ACS三组人群外周血中Th17和Treg细胞占CD4+T淋巴细胞的比例及两群细胞相关细胞因子水平。
2015.7～2016.6 
　　收集SAP和ACS组患者，研究TMZ对老年IHD患者体内Th17/Treg平衡的影响，给予这两个组别在常规治疗基础上加用TMZ治疗1月，并以仅常规治疗的患者作为对照，通过上述指标检测比较治疗前后Th17/Treg平衡变化。
2016.7～2016.12
完成全部实验，综合分析实验数据结果，撰写SCI论文1篇。
预期研究成果：
1) 证明老年IHD患者体内存在Th17/Treg比例或功能失衡。
2) 证明TMZ通过影响老年IHD患者体内Th17/Treg平衡而发挥治疗作用。
3) 发表SCI论文1篇。
研究基础
1.工作基础
　　本课题组多年来主要从事IHD的研究工作，具有较深厚的研究背景，小组成员具备免疫学、细胞生物学、分子生物学等多方面工作经验和理论基础，并熟练掌握了密度梯度离心、流式细胞术、酶联免疫吸附测定等与本项目相关的实验技术，为本项目研究打下了扎实的科研基础。
2.  已取得的研究成果：
1) Sang T, Cao Q, Wang Y, Liu F*, Chen S. () Overexpression or silencing of FOXO3a affects proliferation of endothelial progenitor cells and expression of cell cycle regulatory proteins. PLoS One 2014;9(8): e101703.
2) Fei Wang, Yu-Qiang Wang, Qing Caoa, Jian-Jun Zhang, Li-Ya Huang, Tian-Tian Sang, Fang Liu, Shu-Yan Chen*. Hydrogen peroxide induced impairment of endothelial progenitor cell viability is mediated through a FoxO3a dependant mechanism[J]. Microvasc Res. 2013;90(11):48-54.
3) 刘芳，潘志红，陈书艳*. 老年冠心病合并糖耐量减低患者不同血糖水平与冠状动脉病变的研究.中华老年心脑血管病杂志. 2013;15(3):255-257.
4) 黄黎亚，王飞，曹青，刘芳，桑甜甜，陈书艳*. FOXO3a沉默或过表达对内皮祖细胞增殖的影响. 中国细胞生物学学报. 2013;35(1):30-35.
5) 刘芳*，潘永瑜，李东霞. 急性冠脉综合征患者血清单核细胞趋化蛋白-1水平检测及其临床意义.中华实用诊断与治疗杂志. 2009;23(1):23-25.
3. 实验条件
　　上海交通大学医学院附属新华医院老年医学科是医院临床重点专科之一，科室有多名老年心血管疾病专家，对本项目研究的老年IHD诊治拥有丰富的临床经验。同时，科室还有多名博士、硕士研究生，将对本项目的开展提供有力支持。上海交通大学医学院附属新华医院科研中心设置齐全，拥有与本项目相关的免疫学、细胞生物学、分子生物学等各类仪器设备，包括流式细胞仪、酶联免疫测定仪、层流无菌室、超净台、细胞培养箱、倒置（荧光）显微镜、低温超速离心机、激光共聚焦显微镜等。上述条件均为本项目的顺利实施提供了可靠保障。
上海交通大学医学院附属新华医院刘芳