曲美他嗪抗防治比剂肾病的作用及机制研究
立论依据
对比剂肾病(contrast-induced nephropathy，CIN)是指应用对比剂后新发生的、未发现其他原因的肾功能障碍或者原有的肾功能障碍加重(血肌酐升高≥25%或者绝对值升高≥5mg/L)。CIN通常是一种一过性的肾损害。随着心血管介入治疗和血管CT成像的广泛开展，CIN发生率随之增加，总的发病率为3%，但合并多种危险因素时，发病率可达50%[1]，如基础肾功能不全、糖尿病、高血压及对比剂使用剂量、种类均是发生CIN的危险因素。虽然CIN的发生率相对较低，但其后果较为严重，可使冠心病患者住院时间延长、住院费用增加，透析治疗甚至是死亡。
目前对CIN防治疗效较肯定的药物有腺苷受体抑制剂[2]及他汀类药物[3]。有临床研究显示，曲美他嗪能够明显降低血清肌酐偏高的患者行血管造影/成形术的CIN的发生率[4,5]；而在接受PCI的糖尿病肾病患者中，这一保护作用也是非常显著的[6]。
CIN的发病机制尚未完全阐明，但普遍认为其发生是多种病理生理机制共同作用的结果。其核心机制为对比剂引起的肾髓质损伤，这是肾脏血流动力学改变、对比剂对肾小管的直接毒性（尤其是线粒体损伤，引起胞内钙离子超载）、活性氧簇(ROS)的大量生成、细胞炎症反应等共同作用的结果[7,8]。
因此我们设想，曲美他嗪对使用对比剂的PCI患者产生了肾脏保护作用，其具体机制可能与其间接使线粒体中葡萄糖氧化得到加强，同时减少细胞内H+、Ca2+、Na+的超载[9]，减少细胞的酮体产生，从而促进维持线粒体的正常功能；抑制ROS的过量产生、控制炎症反应等作用有关。已有动物实验通过组织病理学评分、免疫组化测定MDA、SOD等方法初步观察到了以上变化[10]。
NF-κB作为一个转录因子蛋白家族，参与调控各种炎症因子的基因转录，在炎症反应中占据重要地位。Ras基因既通过Ras-Raf-ERK1/2及Ras-MEKK3-P38途径激活NF-κB，又通过Ras-MEKK4-Jnk途径活化AP1，引发细胞分泌促炎因子[11,12]，从而促进细胞炎症反应。已有细胞学实验发现，抑制Ras-p38 MAPK[8]和Ras-JNK-ATF2[13]途径能够阻止对比剂所引起肾小管内皮细胞的凋亡。
线粒体融合素2基因（Mitofusin 2，Mfn2）在内皮细胞、VSMCs和单核巨噬细胞中都有一定水平的表达，其表达蛋白位于线粒体外膜，它对于调控线粒体的正常功能、抑制ROS的过量产生、控制炎症反应均起着重要作用。申请者的研究发现，Mfn2通过与Ras结合，可下调Ras基因的表达，进而抑制下游炎症反应通路而抑制细胞的炎症反应[14,15]。申请者的研究还发现，Mfn-2基因对于维持线粒体的正常功能、调控其自噬[16]、调节细胞周期亦发挥着重要作用。
本研究旨在通过细胞学实验进一步明确曲美他嗪对于暴露在对比剂环境下肾脏细胞的保护作用，同时通过观察细胞形态学及线粒体结构变化，检测细胞凋亡率、炎症标志物，及Westernblot检测Mfn2及下游信号通路变化来探索该保护作用的分子机制，从而对拓展该药物的临床应用提出更为科学的建议。从而对拓展该药物的临床应用提出更为科学的建议。   
参考文献
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研究内容及研究方案
（1）研究目标
1）从改善组织形态学、维持线粒体结构功能、减少细胞炎症因子释放、降低细胞ROS生成等方面进一步观察曲美他嗪抗对比剂损害肾脏细胞的作用。
2）探索曲美他嗪抗CIN作用可能的分子机制。
3）为拓展曲美他嗪的临床用药指征提出更为科学的建议。
（2）研究内容
研究一般临床对比剂（普通对比剂、等渗对比剂）使用浓度下，预先使用药理作用浓度曲美他嗪干预后肾小管上皮细胞、肾小球血管内皮细胞、足细胞的形态变化、细胞的凋亡率，电镜观察线粒体结构功能，检测炎症标志物IL-6，CRP，TGF-β，Westernblot测定Mfn2-JNK、Mfn2-P38、Mfn2-ERK1/2等信号通路的变化。
（3）研究方案
    实验材料：肾小管上皮细胞、肾小球血管内皮细胞、足细胞，针对3种细胞，分别进行实验研究，每次实验分组如下：
    实验分组：A.正常组 
B.实验细胞+对比剂（普通、等渗） 
C.实验细胞+对比剂（普通、等渗）+曲美他嗪5μmol/L
D.实验细胞+对比剂（普通、等渗）+曲美他嗪10μmol/L 
E.实验细胞+对比剂（普通、等渗）+曲美他嗪20μmol/L
    实验方法：光镜观察细胞形态变化；电镜观察线粒体形态功能改变；
CCK-8法检测细胞的凋亡率；
ELISA检测炎症标志物IL-6，CRP，TGF-β；
Westernblot测定Mfn2-JNK、Mfn2-P38、Mfn2-ERK1/2等信号通路的变化。
（4）研究计划及预期研究成果：
1）研究计划：
2015.3-2015.6    实验试剂购置、准备
2015.6-2016.6    细胞学实验阶段
2016.6-2016.12   实验结果整理总结及论文撰写
2）预期成果：
从改善组织形态学、维持线粒体结构功能、减少细胞炎症因子释放、降低细胞ROS生成等方面进一步观察曲美他嗪抗对比剂损害肾脏细胞的保护作用，探索曲美他嗪抗CIN保护作用可能的分子机制。为拓展曲美他嗪的临床用药指征提出更为科学的建议。
拟发表核心论文1篇； SCI论文一篇
研究基础
申请者所在单位华中科技大学附属同济医院心血管内科，为国家教育部和卫生部重点学科，有现代化的冠心病研究室和分子生物学研究中心，科室先后共完成了 40 余项国家自然科学基金项目，建立了完善的研究体系，树立了良好的科研工作风范，积累了大量成功的研究经验和先进技术。
申请者从事冠心病的防治工作三十余年，主要致力于分子心脏病学、冠心病的诊断与防治研究和介入心脏病学的实验研究，对动脉粥样硬化的防治有较深入的研究。申请者在美国国家卫生研究所攻读博士后期间主要从事Mfn2 基因的研究，2004 年底以第二作者在Nature Cell Biology（6(9)：872-883）上发表有关该基因抑制血管平滑肌细胞增殖的凋亡及机理，2007 年底在Circulation Research（101：1113－1122）上发表有关该基因诱导平滑肌细胞凋亡的现象和机理。回国后主持过三项国家自然基金项目，三项基金已经结题，并取得预期结果。
我们已具备了研究相关的全部细胞生物学、分子生物学及大小动物实验研究的研究设备与条件。本研究所需要的实验方法与技术是我科分子生物学实验研究中心、同济医学院卫生部开放实验室（已落实本课题的实验计划与安排，实验室编号 23619101）较常用的方法和技术。
我们前期的预实验也已证明，在使用对比剂刺激同时使用曲美他嗪能够上调Mfn-2的表达，Ras表达亦随之下降，而下游炎症通路是否受到抑制进而下调炎症因子表达、是否能改善线粒体功能，尚待该计划的进一步研究。
华中科技大学同济医学院附属同济医院郭小梅