曲美他嗪抑制CaMKII过度激活、防治慢性心力衰竭的作用及机制研究
立论依据
　　心血管疾病已经成为国人第一位的死亡原因，而心力衰竭是心血管病致死的最主要和直接原因，为各种心脏病的严重阶段，其发病率高，5年存活率与恶性肿瘤相仿，是21世纪最重要的心血管病症[1]。尽管近年来由于治疗药物的进步使心力衰竭病人的临床预后有所改善，但是由于其病因不能根除和病理生理机制没有完全明了，绝大部分患者仍然无法控制病情发展而走向终末期心力衰竭[2]。因此，迫切需要有效的措施改善或延缓心衰的进展，降低心衰的死亡率和住院率。
曲美他嗦（Trimetazidine，TMZ）是一种改善心肌代谢的药物，经常被单独或与其他药物联合应用，来治疗急性冠脉综合征或稳定型心绞痛[3]。新近研究显示，该类药物亦能改善心力衰竭患者的心脏功能。研究显示曲美他嗪对心肌细胞的保护作用，主要是通过减少细胞内H+、Ca2+、Na+的超载[4]。近年来，随着心肌钙信号研究的进展，人们将心肌钙相关信号转导机制与心肌功能相联系，揭示了心力衰竭的病理生理本质，并对心力衰竭的治疗有十分重要的指导意义[5]。
一、心肌细胞中的Ca2+、钙调蛋白、Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶
Ca2+是生物体内最广泛和最重要的信使物质之一，参与包括细胞增殖分化、生长衰老等一系列生命活动的信息传递与调控，在肌肉兴奋收缩、血管张力调节、神经冲动传导等各种生理活动中都起着非常重要的作用，其代谢和信号转导的异常与许多重要疾病的发生、发展有非常密切的关系[6]。
在心肌细胞接受刺激后，Ca2+由肌浆网或内质网释放，升高到一定浓度与钙调蛋白（CaM）结合，导致后者构象改变，激活Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶（CaMKII），CaMKII是在体内广泛存在的丝/苏酸蛋白激酶，CaMKII激活后则可以通过自身磷酸化进一步增强对CaM的亲和力，并磷酸化多种靶蛋白产生广泛的生物学作用，参与许多细胞功能包括突触信息的传递、调节基因表达、改变离子通道的功能等[7]。
　　在心肌细胞内Ca2+的浓度受到心肌肌浆网钙ATP酶（SERCA）、受磷蛋白（PLB）等多种调节因素的影响。SERCA可主动回收Ca2+，而PLB是心肌收缩的一个重要调节因子，可抑制SERCA的活性和降低其对钙的亲和力，PLB可被不同的蛋白激酶磷酸化从而解除其SERCA的抑制作用，例如蛋白激酶A（PKA）对其Ser-16的磷酸化或CaMKII对Thr-17的磷酸化可解除这种抑制作用[8]。
　　CaMKII在哺乳动物细胞中具有α、β、γ、δ 4种基因，4种基因在哺乳动物的不同组织内表达量有差异，α和β在脑内高表达，γ和δ在全身都有表达，在哺乳动物心脏的研究显示δ表达丰富并具有重要作用[9]。
二、心力衰竭中CaMKII通路激活
心衰时CaMKII表达和活性增加，CaMKII的过表达又可引起心肌肥厚，进一步加重心力衰竭，形成恶性循环。大量证据表明， CaMKII在心肌肥厚和心力衰竭过程中发挥重要作用。Kashiwase等[10]研究发现采用表达CaMKIIδ的腺相关病毒载体体外转染心肌细胞，过度表达CaMKIIδ可诱导心肌肥大，应用CaMKII特异性抑制剂KN-93可抑制心肌细胞肥大的形成。另外，研究表明过度表达CaMKIIδ的转基因鼠心肌收缩功能明显下降，心室明显扩张，最终发生心力衰竭[11]。在体研究表明扩张型心肌病伴心力衰竭患者心肌组织CaMKII的活性升高20%，而且CaMKII的活性升高与心功能变化呈负相关[12]。心肌细胞凋亡是心力衰竭的机制之一，CaMKII能够传导凋亡信号，如选择性抑制CaMKII，能够明显抑制肿瘤坏死因子α( TNF-α) 导致的凋亡。CaMKIIδ转基因大鼠发生心力衰竭伴有明显心室变薄, 也提示在CaMKII的参与下发生凋亡[13]。我们前期的研究已经发现，β肾上腺素受体持久激活可通过CaMKIIδ传导的通路导致心肌凋亡，β受体抑制剂能通过抑制CaMKIIδ的活性及表达来减轻心肌细胞凋亡，改善心力衰竭（见工作基础）。这些研究结果提示CaMKIIδ信号通路和心力衰竭的发展中具有重要的病理生理作用，抑制CaMKIIδ通路能减少心肌细胞凋亡减轻心力衰竭。
3.  曲美他嗪可能通过抑制CaMKII激活，减轻心肌细胞内钙超载，减少心肌细胞凋亡
  　曲美他嗪是一种新型的影响心肌代谢类药物，通过抑制线粒体内长链3-酮酰辅酶A硫解酶而抑制游离脂肪酸β-氧化，增强葡萄糖的有氧氧化，使心肌对脂肪酸的利用率降低，维持ATP的水平，从而优化心肌能量代谢[14]。近年来研究发现，曲美他嗪有不依赖于代谢调控的其它作用机制，研究表明曲美他嗪也可通过抑制Na+、Ca2+的超载，抑制氧自由基的产生，调节线粒体功能，从而起到保护心肌细胞的作用[4]，但曲美他嗪抑制Ca2+的超载的机制目前尚未明确。而CaMKII对细胞内钙离子浓度的稳定起重要作用，心力衰竭时CaMKII的表达和活性均增高，进一步加重了细胞内钙超载诱发细胞凋亡。于是，我们提出假设：曲美他嗪通过抑制CaMKII过度激活，减轻细胞内钙超载，减少心肌细胞凋亡，从而保护心肌，防治慢性心力衰竭。
本课题设计拟同时使用心力衰竭的动物模型、培养的心肌细胞证实上述假设，这些实验结果将不但能深入阐明心力衰竭的机制，而且能为曲美他嗪治疗心力衰竭提供理论基础。
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（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，请附主要参考文献及出处）
三、研究内容及研究方案
1. 研究目标、研究内容和拟解决的关键问题；
1.1 研究目标：
本研究旨在揭示曲美他嗪治疗慢性心衰的病理生理机制，并为心力衰竭治疗提供新的治疗靶点及方案。我们确定了2个具体的研究目标：
（1）在慢性心力衰竭小鼠模型中，明确曲美他嗪能否抑制CaMKII的表达和激活、减轻细胞凋亡、改善心肌肥厚、减轻心力衰竭；
（2）在体外培养的心肌细胞中，进一步明确曲美他嗪抑制CaMKII的表达和激活、减轻细胞凋亡的分子机制。
1.2 研究内容：
（1）体内实验：在慢性心力衰竭小鼠模型中，明确曲美他嗪（TMZ）能否抑制CaMKII的表达和激活、减轻细胞凋亡、改善心肌肥厚、减轻心力衰竭；
1）心衰动物模型建立及动物分组：普通C57BL/6小鼠皮下植入异丙肾上腺素（Iso，30mg/kg/d，14天）渗透性微泵，建立心力衰竭模型；动物分4组：control组、TMZ组（20mg/kg/d，灌胃）、Iso组、Iso+ TMZ组（20mg/kg/d，灌胃）；
2）在上述动物模型中进行如下检测：
①心功能检测：应用高频超声和Millar导管系统检测动物心脏功能，研究曲美他嗪对心肌肥大心力衰竭的心脏收缩和舒张功能的保护作用；
②心肌肥大指标检测：实验终点取动物心脏标本，测量心脏体重比值评估小鼠心肌肥大程度，用组织学方法观察心肌组织形态、细胞大小，研究曲美他嗪对心肌肥大的改善作用；
③CaMKII通路检测：用Western Blots、实时荧光定量PCR方法及免疫组织化学方法检测心肌CaMKII通路相关蛋白（SERCA、PLB、CaMKIIδ等）的表达及激活情况，来研究曲美他嗪对心肌细胞CaMKII通路的调控作用；
④细胞凋亡检测：用TUNEL方法检测心肌细胞凋亡，Western Blots检测凋亡通路相关蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、Bax、JNK通路相关蛋白等）的表达，研究曲美他嗪对心肌细胞凋亡的抑制作用；
⑤细胞内钙离子及钙通道检测：使用Fluo-4 NW试剂盒（Invitrogen）检测细胞内Ca2+浓度，利用Ca2+- ATPase 测定试剂盒（南京建成）检测SERCA2a活性[15]。
（2）体外实验：在培养的心肌细胞中，研究曲美他嗪抑制CaMKII的表达和激活、减轻细胞凋亡的分子机制；
1）细胞培养及细胞分组：采用H9c2心肌细胞系及原代心肌细胞培养，细胞分组：control组、TMZ组、Iso组、Iso+ TMZ组；
2）在上述细胞分组中进行如下检测：
①CaMKII通路检测：用Western Blots、实时荧光定量PCR方法检测心肌CaMKII通路相关蛋白（SERCA、PLB、CaMKIIδ等）的表达及激活情况，来研究曲美他嗪对心肌细胞CaMKII通路的调控作用；
②细胞凋亡检测：用Annexin V/PI双染试剂盒及流式细胞学方法检测心肌细胞凋亡，Western Blots检测凋亡通路相关蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、Bax、JNK通路相关蛋白等）的表达，研究曲美他嗪对心肌细胞凋亡的抑制作用；
③细胞内钙离子及钙通道检测：使用Fluo-4 NW试剂盒（Invitrogen）检测细胞内Ca2+浓度，利用Ca2+- ATPase 测定试剂盒（南京建成）检测SERCA2a活性[15]。
1.3拟解决的关键问题：
（1）明确曲美他嗪能否抑制慢性心力衰竭小鼠心肌细胞CaMKII的表达和激活、减轻细胞钙超载、减少细胞凋亡、改善心肌肥厚及心力衰竭；
（2）明确曲美他嗪抑制CaMKII的表达和激活、减轻细胞钙超载、减少细胞凋亡的分子机制。

2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析、统计学方法；
2.1 相关研究方法及统计学方法：
（1）细胞培养：
采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养H9c2心肌细胞系。原代心肌细胞培养：无菌条件下开胸取出SD乳鼠（1-3d）心脏，剪碎1-3mm3大小，以0.08%胰蛋白酶消化5min左右，10%胎牛血清培养基终止消化，反复数次，直至碎片完全消化。将细胞以培养基悬浮，收集于培养瓶中，差速贴壁60min后，吸取未贴壁细胞至新培养瓶中。心肌细胞培养48h后，加入0.1mmol/L的5-BrdU，以抑制非心肌细胞的生长。镜下观察细胞跳动及免疫组化α-actin鉴定心肌细胞。
（2）小鼠心脏超声检测：
使用仪器为配有30MHz 高频探头的VisualSonic Vevo770 型超声仪（VisualSonics Inc.,Toronto, ON, Canada）。在使用异氟烷麻醉小鼠后，将小鼠仰卧放置于检测平台，沿小鼠胸骨旁左室乳头肌水平短轴和长轴切面采集左室而为图像，同时在二维图像引导下分别获取5 个以上连续心动周期M 型超声影像。根据采集影像使用软件分析结果，分别得到心率（Heart rate，HR），左室收缩末容积（LV end-systolic internal diameter，LVIDES），左室舒张末容积（LV end-diastolic internal diameter，LVIDED），左室后壁厚度（posterior end-diastolic wall thickness，PWT），室间隔厚度（Interventricular septalthickness，IVS），射血分数（LV Ejection Fractions，EF），左室缩短分数（Fractionalshortening，FS）等数据。
（3）Millar导管系统检测小鼠血流动力学指标：
① 小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（50mg/kg）诱导麻醉后，用氟烷维持麻醉，固定于小动物手术台；
② 颈部正中剪一长约2cm的竖形切口，钝性分离各层组织，暴露右颈总动脉鞘后，小心游离约1cm长的颈动脉；结扎颈动脉远心端，动脉夹夹闭近心端；
③ 在远心端作一斜形向心切口，将前端带有电极的P-V微导管（SPR-838, Millar Instruments, Houston, TX）经右颈总动脉插入至主动脉，导管通过压力-容积传导系统（Millar instruments）连接PowerLab/4SP A/D 转换器与MS-302多媒体生物信号采集分析系统连接，动态观察压力波形变化，稳定数分钟后记录动脉波形；
④ 将导管缓慢向左心室送入，根据监视仪上显示的波形变化，直至出现较好的压力-容积环图形，确认导管进入左心室后固定导管；
⑤ 小鼠稳定20分钟，连续记录压力、容积变化，以获得稳态的血流动力学数据；血流动力学数据经压力-容积分析软件（PVAN）处理后获得，包括心率（HR）, 左室收缩末压（LV end-systolic pressure, LVESP），左室舒张末压（LV end-diastolic pressure, LVEDP），左室压力最大上升和下降速率（±dP/dt max）等。
（4）钙离子清除率和SERCA动态功能测定：
钙离子清除率测定是按照Ma R所述的方法指导下进行的。培养的细胞用胰酶消化再离心收集，每次约需1X106 个细胞。细胞用含有140mM氯化钠、5mM氯化钾、1.8mM氯化钙、10mM葡萄糖、0.1%BSA、15mMhepes，PH值为7.4重悬后的ECS缓冲液洗涤，再用含有0.05%Pluronic F-127的浓度为2μM的indo-1/AM标记细胞，此混合物在室温下震摇45min。Indo-1/AM标记的细胞用不含氯化钙的ECS缓冲液洗涤三遍。然后用含有10 μM无钙EGTA的ESC/EGTA缓冲液重悬。取2ml indo-1/AM标记的细胞用于钙离子比率测定。在30秒平衡后，向细胞悬液中滴加10μM Ionomycin，以用来促进钙离子从内质网钙池中释放。钙离子清除率是通过带有350nm激发光和405和485nm发射光单色仪的PDI荧光分光光度计测的胞内游离钙离子浓度来表示的。内质网内相对钙离子储存量，曲线变化程度，胞浆内钙离子浓度回归基础水平的时间都可以得到相应的分析。
（5）统计学方法：
应用SPSS 12 统计软件包进行数据处理，计量资料以(x±s) 表示，组间均数比较采用ANOVA 检验，以P< 0.05为差异有统计学意义。
2.2 技术路线及实验方案
2.3 可行性分析
（1）    从研究工作基础看：
① 申请人先后参与华中科技大学同济医院汪道文等教授多项国家和部级课题的研究工作，受到严格而系统的科研工作训练，熟练的掌握细胞培养、PCR、免疫印迹、免疫组化、基因克隆、病毒包装等实验技术；申请人长期从事心血管疾病基础研究，熟练掌握小鼠Millar导管、细胞膜片钳等重要实验检测手段，能够独立完成从分子生物学水平、细胞水平到动物模型水平，及后续病理研究等一系列的科研操作，并作出了突出的成绩。因此，申请人及其团队具备完成本项目的能力和实力。
② 有相应的工作基础：申请者本人作为多项国家自然科学基金和相关项目的负责人、主要成员和参与者，一直从事心力衰竭等心血管疾病领域的研究工作，作出了一系列工作成绩，对该领域研究工作和进展十分熟悉。尤其是在心力衰竭发病的生理病理机制及其干预研究中，有原始创新性研究工作，相关论文已于心血管领域高影响因子杂志发表或修回（具体见后面申请人参与及完成自然科学基金项目情况及申请人简介）。
③ 本课题的论点源于我们前期的研究基础，本研究小组发现心力衰竭大鼠心肌CaMKII的表达和活性增加，β受体抑制剂能通过抑制CaMKII减轻心肌细胞凋亡改善心力衰竭，本课题在“提出问题—分析问题—解决问题”的各个环节都有坚实的理论基础，且可操作性强。本课题经过科学合理设计，所采用的实验技术均是目前常用且成熟的技术。
（2）实验条件：
本项目将在华中科技大学附属同济医院高血压研究所暨基因治疗研究中心完成。本研究所有实验室面积超过620 M2，装备有完善的细胞和分子生物学研究设备、膜片钳和大小动物血流动力学和血压（有创和无创）检测等设备，还装备有HPLC-荧光和紫外光检测器、高速离心机和Beckman液闪仪等，装备有遗传学研究技术平台（包括ABI基因测序仪、7900基因分析仪）等，总价值超过1200万元；同济医院和医学院均有多台流式细胞仪、共聚焦显微镜等。总之，实验条件能够满足本项目研究的需要。
（3）研究人员素质：
① 申请人本人在华中科技大学附属同济医院汪道文教授实验室受到严格和系统的科研工作训练。本高血压研究所暨基因治疗中心已经形成了较强的基础研究的科研队伍。研究室负责人汪道文教授在美国从事分子生物研究4年，回国后连年获得国家自然科学基金资助，并且形成了鲜明的特色，建立了研究平台，组织了相关的研究团队。实验室内除兼职人员外，还有专职研究人员3人，博士生、博士后人员及硕士研究生30余人。实验室内有规范的管理和良好的科研研究训练，因此从人员素质方面能保证项目的完成。
② 申请者所在的华中科技大学附属同济医院心血管实验室（高血压研究所暨基因治疗中心），近几年围绕心力衰竭发病的生理病理机制、治疗心力衰竭药物的新靶点的作用及机制等课题进行了大量的研究，有很多原创性工作，相关多篇论文已于心血管领域高影响因子杂志发表或修回（Arterioscler Thromb Vasc Biol，Molecular Pharmacology，PloS ONE，J Lipid Res, Diabetes等）
③ 本项目所涉及的分子生物学技术大部分系本研究中心日常研究方法，部分内容涉及新的方法也均有可靠的技术和条件支持，并能保证在我们的研究中心完成。
（4）项目依托执行单位的支持：
本项目获得资助后，同济医院在实验条件、学科建设和人员、实验室面积等方面给予强有力的支持。
基于上述分析，实现本项目的目标是完全可行的。如果本项目获得资助，我们在人力、物力及技术条件等方面都能保证本项目按期或提前完成，获得满意的研究成果。
3. 研究计划及预期研究成果。
时间（年、月）    研究内容    考核指标
2015.4-2015.12    在体动物研究    曲美他嗪抑制心力衰竭大鼠心肌CaMKII通路、减轻细胞凋亡、改善心肌肥厚、减轻心力衰竭的作用
2016.1-2016.12    体外细胞学研究    曲美他嗪抑制心肌细胞CAMII通路，减轻胞内钙超载减少细胞凋亡分子机制研究
2017.1-2017.4    整理及总结数据、撰写论文及投稿    提交论文
争取发表研究论文1-2篇，其中一篇SCI，为曲美他嗪治疗慢性心力衰竭提供理论依据。
四、研究基础
（申请者与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩，申请者已具备的实验条件、尚缺少的实验条件和拟解决的途径）
1. 申请者与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩
（1）申请人素质：
申请者本人在博士研究生期间及工作后，参与完成过多项包括国家自然科学基金面上及重点项目、863、973等项目，在此过程中受过多年严格的分子生物学正规训练，掌握了各项分子生物学实验技能，并在多年的临床实践和科研训练中积累了较强的动手和逻辑分析能力。申请人承担国家自然科学基金（青年基金）一项：花生四烯酸细胞色素P450（AA-CYP）表氧化酶代谢物EETs抗心肌内质网应激损伤、防治心力衰竭的作用及机制研究，编号：81000097，（2011年1月-2013年12月，20万元），已结题。申请人所在实验室在一系列国家自然科学基金：“心力衰竭中β1肾上腺受体通路的持久激活与CaMKIIδ可变剪接的诱导（30571841）”、“内质网应激通路激活介导的心肌损伤和心力衰竭及其干预研究（30770882）” “内质网应激介导激活的C/EBP同源蛋白(CHOP)在腹主动脉瘤发病中的作用及机制研究（81370417）”等的资助下，一直从事心力衰竭等心血管疾病的基础研究工作，做出了很多原创性的工作成绩。
（2）申请者主要承担或参与的与本次项目相关课题如下：
1）国家自然科学基金青年基金项目：花生四烯酸细胞色素P450（AA-CYP）表氧化酶代谢物EETs抗心肌内质网应激损伤、防治心力衰竭的作用及机制研究。编号：81000097，（2011年1月-2013年12月，20万元）（项目负责人），已结题。申请人全面负责上述青年项目的设计、组织实施、论文撰写和项目总结等。
2）国家自然科学基金面上项目：项目名称：钠通道异常、钠钙超载诱导的内质网应激在心力衰竭中的作用及机制研究。编号：81470519，（2015年1月-2018年12月，73万元）（项目负责人），在研。申请人全面负责上述青年项目的设计、组织实施、论文撰写和项目总结等。
3）国家自然科学基金面上项目：心力衰竭中β1肾上腺受体通路的持久激活与CaMKIIδ可变剪接的诱导。编号：30571841，（2006年1月-2008年12月，26万元）（主要参与者），已结题。该项目研究钙离子调节蛋白在心力衰竭中的作用及机制，为本次申请项目的基础工作。申请人负责具体动物、细胞、分子生物学实验，并撰写论文、总结项目等。
4）国家自然科学基金面上项目：内质网应激通路激活介导的心肌损伤和心力衰竭及其干预研究。编号：30770882，（2008年1月-2010年12月，30万元）（第二参与者），已结题。申请人负责项目申报和具体动物、细胞、分子生物学实验，并撰写论文、总结项目等。
5）国家自然科学基金面上项目：内质网应激介导激活的C/EBP同源蛋白(CHOP)在腹主动脉瘤发病中的作用及机制研究。编号：81370417，（2013年1月-2016年12月，70万元）（第二参与者），在研。申请人负责项目申报、设计、组织实施、论文撰写等。
6）国家973项目：心力衰竭与恶性心律失常的防治基础研究之心力衰竭的代谢、凋亡机制。编号：2007CB512004，（2007年7月-2011年8月）（主要参与者），结题。该项目研究心力衰竭的代谢凋亡机制，为本次申请项目的基础。申请人负责项目设计及具体动物、细胞、分子生物学实验，并撰写论文、总结项目等。
（3）申请人简历：
姓名：倪黎
所在单位及职称：华中科技大学，同济医学院附属同济医院心内科，主治医师
受教育经历：
2006/09–2009/06，华中科技大学，同济医学院附属同济医院心内科，博士；2004/09–2006/06，华中科技大学，同济医学院附属同济医院心内科，硕士；
1998/09–2004/06，华中科技大学，同济医学院临床医学专业本科，学士。
主要论著
期刊论文：（通讯作者以“*”标出）
1. Ni L, Lü J, Hou LB, Yan JT, Fan Q, Hui R, Cianflone K, Wang W*, Wang DW*. Cystatin C, Associated With Hemorrhagic and Ischemic Stroke, Is a Strong Predictor of the Risk of Cardiovascular Events and Death in Chinese. Stroke, 38(12):3287-8, 2007. (IF=6.296)
2. Ni L, Zhou C, Duan Q, Lv J, Fu X, Xia Y*, Wang DW*. β-AR Blockers Suppresses ER Stress in Cardiac Hypertrophy and Heart Failure. PLoS One, 6(11):e27294, 2011. (IF=4.092)
3. Wang X#, Ni L#, Yang L, Duan Q, Chen C, Edin ML, Zeldin DC, Wang DW*. CYP2J2-Derived Epoxyeicosatrienoic Acids Suppress Endoplasmic Reticulum Stress in Heart Failure. Mol Pharmacol. 2014;85(1):105-15. (IF=4.441)
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6. Cai Z, Li F, Gong W , Liu W, Duan Q, Chen C, Ni L, Xia Y, Cianflone K, Dong N*, Wang DW*. Endoplasmic Reticulum Stress Participates in Aortic Valve Calcification in Hypercholesterolemic Animals. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 33 (10):2345-2354, 2013. (IF=6.338)
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8. 倪黎，汪道文*. 花生四烯酸细胞色素P450代谢与心血管保护. 中华心血管病杂志, 38(4): 377-379, 2010.
9. 周昌清，倪黎，晏小妮，关红菁，付向宁，汪道文*. 美托洛尔下调CaMKIIδC-p38通路对异丙肾上腺素诱导心力衰竭的保护机制。中国分子心脏病学杂志, 42: 255-263, 2008.
10. 周昌清，倪黎，晏小妮，关红菁，陈琛，汪道文*. β1-AR持久兴奋通过CaMKIIδ-内质网应激凋亡通路导致心力衰竭的机制. 中国分子心脏病学杂志, 43;319-327, 2008.
11. 吕家高, 倪黎, 严江涛, 汪道文*. 血浆胱氨酸蛋白酶抑制剂C水平与脑出血关系的病例对照研究. 中华老年心脑血管病杂志, 8(9), 610-612, 2006.
12. 吕家高, 倪黎, 汪道文*. 115例心包积液患者病因及误诊分析. 临床内科杂志, 23(3),191-192, 2006.
13. 严江涛，王焱燚，倪黎，侯凌波，惠汝太，汪道文*. 血浆高敏C反应蛋白与脑卒中预后. 中华神经科杂志, 41(6):376-380, 2008.
14. 关红菁，汪培华，周昌清，倪黎，汪道文*. 腺相关病毒介导的转人C-反应蛋白基因诱导大鼠高血压形成. 中国分子心脏病学杂志, 40; 127-130, 2008.
会议论文：
1. Ni L, Zhou C, Yan X, Duan Q, Fu X, Wang DW*. Sustained β-adrenergic stimulation leading to heart failure is associated with activation of CaMKII via p38MAPK pathway. the World Hypertension Congress 2009, International Journal of Cardiology, Volume 137, Supplement 1 , Page S142, Bei Jing, Oct 29~Nov 1, Poster presentation and discussion;
2. 倪黎, 吕家高, 严江涛, 范巧, 惠汝太, 王伟, 汪道文*. 胱抑素C是中国人群心血管事件和全因死亡的一个强预报因子. 中华医学会第11次心血管病学术会议, 大连，2009年6月，壁报交流；
3. 唐家荣, 晏小妮, 周昌清, 倪黎, 汪道文*. 替米沙坦对腹主动脉缩窄大鼠内质网应激相关心肌细胞凋亡的影响. 中华医学会第11次心血管病学术会议, 大连，2009年6月，壁报交流；
4. 倪黎，汪道文*. 心力衰竭的新机制和防治策略：内质网和β受体阻断剂. 北京国际心血管病论坛心血管病转化医学峰会，北京，2008年9月，专题报告；
5. 倪黎，汪道文*. 内质网应激与心力衰竭. 第二届东方心脏病学会议，上海，2008年5月，专题报告；
6. 倪黎，周昌清，段全炉，吕家高，付向宁，汪道文*. 倍他受体阻滞剂抑制心力衰竭小鼠心肌内质网应激. 第三届中部心脏病学会议，武汉，2013年4月，大会报告。
（4）前期相关工作基础：
1）肾上腺素诱导心力衰竭大鼠CaMKIIδ蛋白表达明显高于空白对照组P<0.05） 
注：参数均以均数±标准差表示。n=10. *P<0.05, 与对照组比较；?P<0.05,与异丙肾上腺素组比较。
2）肾上腺素诱导心力衰竭大鼠CaMKII活性明显高于正常对照组（P<0.05）
注：参数均以均数±标准差表示。n=10. *P<0.05, 与对照组比较；?P<0.05,与异丙肾上腺素组比较。
2. 申请者已具备的实验条件：
（1）申请人现在同济医院心内科工作，大多数时候都能在实验室参加和直接指导实验工作。申请人团队长期从事心血管疾病基础研究，熟练本项目所需的各种实验技术。这些为完成本项目提供了最重要保证；
（2）本项目将在我们高血压研究所暨基因治疗中心完成。此中心先后承担了12个国家和5个部省级研究项目，培养了28名生化/分子生物学及临床学科的博士研究生和博士后人员，46名硕士研究生。现有专职研究人员3人，博士及硕士生30人。在这里接受了严格的分子生物和细胞生物学学研究训练，已经形成了一支非常优秀的研究队伍。申请者在本中心完成博士研究，现在同济医院心内科工作，而且大多数时候都能在实验室参加和直接指导实验工作。同时申请者已有从事内心力衰竭与CAMKII研究的相关经验。这些为完成本项目提供了最重要保证。
（3）本中心已经形成了国内一流的分子及细胞生物学实验室，与国外相应的实验室条件相当。包括620平方米面积的实验室（中央空调）、暗室、完备的分子及细胞生物学实验设备，2个细胞室、4个超净工作台和一个安全柜，4个CO2培养箱等，6台-80oC冰箱，7套Bio-Rad中小SDS-PAGE装置、2个120L液氮罐、杂交炉、电泳、凝胶成像及分析系统，测序-干胶系统、Beckman高速离心机、大型摇床和制水制冰机等等。能在实验室内完成而且常规进行基因克隆、Northern，Southern，Western Blots，基因测序实验，进行载体构件、病毒包装、转基因等实验；
（4）实验室装备了心血管专业研究的相关仪器，包括2台多导电生理仪（8导仪为美国 GE Marqutte KASE3000；4导仪为澳大利亚产品）、小动物动脉血压测量仪、心电图机、膜片钳等；Millar 心内导管检测系统（心脏血流动力测定）；HPLC(Waters公司)加荧光检测系统(Waters)、紫外检测器、同位素检测器系统(Pakard公司)和液体闪烁计数器(Beckman LS6500)等
（5）遗传学工作站：包括Real-Time PCR仪，新型基因测序仪、ABI7900基因分析仪和6台不同类型的PCR仪（包括高通量PCR仪）等设备。
（6）我们拥有无菌级动物房及实验室，可进行清洁级动物饲养和相关实验，本研究所需要的实验动物均已经到位。
总之，无论从人员素质、已经具有的实验室和实验室装备、我们的工作基础及经费等完全能保证本项目的完成。不需要添置大仪器设备。根据我们的条件，尤其是我们已经得到的初步研究结果看，预期能顺利完成并得到令人振奋的研究结果。
3．尚缺少的实验条件和拟解决的途径
无
华中科技大学附属同济医院倪黎