曲美他嗪联合运动对心肌梗死小鼠左室重构的影响及机制
立论依据
立项依据与研究内容
1.项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研　　究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）；
研究意义
　　随着溶栓和介入等治疗技术的广泛开展,急性心肌梗死患者的生存率大大提高,但即使给予目前最优化的药物治疗,仍有不少心梗后患者由于心肌重构而发生心脏扩大、心力衰竭，后者常使患者反复住院，而不能恢复正常的生活和工作，并增加患者的死亡率[1，2]。
　　已有大量文献报道，运动训练是缺血性患者的有效的治疗措施[3-6]。Giallauria F[7]等人研究证实心梗后早期的运动训练可减少劳力性心肌缺血并改善左室室壁运动及厚度，提示运动对心肌灌注及心肌功能的影响与改善左室重塑及心血管功能能力相关。一项荟萃分析[8]证实，耐力训练可逆转左室重构，使左室收缩和舒张末期容积显著下降，同时增加左室射血分数。以运动为基础的心脏康复治疗还可减少心肌梗死后死亡率及再梗的发生，改善患者的远期预后。其安全性及有效性已得到证实[9]。研究表明，运动训练可以直接或间接作用于心血管系统，对机体氧、血管内皮功能、自主神经平衡、凝血系统和炎症状态均有不同程度的改善[10]。因此，心脏的运动康复已越来越得到重视，美国心脏病协会及欧洲心血管预防及康复协会均将运动训练列为心脏康复的一项重要治疗措施。
    曲美他嗪是一种长链3-酮酰辅酶A硫解酶(3-KAT)抑制剂，其通过抑制游离脂肪酸代谢，使心肌以葡萄糖代谢为主产生能量，在心肌供氧受到限制时，可提高氧的利用度，提高三磷酸腺苷(ATP)生成的效率和保护线粒体的结构和功能, 提高心肌细胞对缺氧的耐受性, 而不影响血流动力学, 无显著的负性肌力和血管扩张作用[11]。临床研究表明，冠心病稳定性心绞痛患者在常规治疗基础上加用曲美他嗪，可增加患者的运动耐量，减少心绞痛发作[12，13]。另有研究证实曲美他嗪可改善糖尿病和缺血性心肌病患者的左室功能[14]。
　　因此，有理由推测曲美他嗪联合有氧运动能给缺血心肌带来更大的益处。但目前曲美他嗪联合有氧运动对心肌梗死后左室重构影响的研究报道较少。本实验通过建立小鼠心肌梗死模型，设运动、曲美他嗪、运动联合曲美他嗪干预组、心肌梗死组和假手术对照组，观察曲美他嗪基础上联合运动治疗对梗死后心肌细胞的保护及内皮细胞再生的疗效，以探讨促进心梗后患者心脏康复、减少心肌重构发生的方法和机制，为缺血性心肌病防治提供新的实验依据。
参考文献
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研究内容及研究方案
3.1 项目的研究内容、研究目标及拟解决的关键科学问题
3.1.1研究内容
1.建立心肌梗死动物模型
2.比较运动、曲美他嗪及运动联合曲美他嗪治疗对心梗小鼠心肌梗死面积和左室大小及形态的影响
3.观察运动联合曲美他嗪治疗对心梗小鼠心肌细胞存活的影响
4.观察运动联合曲美他嗪治疗对心梗小鼠内皮细胞增殖与凋亡的影响
5.比较各组间处理对心梗小鼠治疗前后BNP及cTNT水平的影响
3.1.2研究目标
1.明确运动联合曲美他嗪治疗对心梗小鼠梗死面积、心肌细胞凋亡指数、内皮细胞增殖与凋亡的影响
2.探讨运动联合曲美他嗪治疗对心脏康复的影响
3.1.3 拟解决的关键科学问题
1.运动联合曲美他嗪治疗是否是更优的缩小心梗小鼠梗死面积、减少心肌细胞凋亡、促进内皮细胞增殖的方案
2.运动联合曲美他嗪治疗是否有益于心脏康复
3.2 拟采取的研究方案及可行性分析（包括研究方法、技术路线、实验手段、统计学方法等说明）
3.2.1 研究方法
（1）实验动物：昆明小鼠
（2）心梗动物模型建立：100只小鼠，雌雄各半，人为结扎冠脉诱导小鼠产生心梗。具体步骤：对实验小鼠进行气管插管通气，使用2%异氟烷吸入麻醉。从左胸第四肋间隙开胸，找出并游离左冠状动脉，用8-0尼龙丝线结扎血管后关闭胸腔。假手术对照组只打开胸腔，拨动探查后关闭胸腔。（参考方法：Nature 2012; 487: 325-9）
（3）动物分组及给药方式：建模成功后随机分为运动治疗组( n =25) 、曲美他嗪组( n =25) 、运动联合曲美他嗪治疗组 ( n = 25)、安慰剂组（n = 25）、假手术组（n = 25）。术后一周，。假手术对照组只打开胸腔，拨动探查后关闭胸腔；安慰剂组灌胃给予生理盐水，按2 mL /kg 给予; 曲美他嗪治疗组，灌胃给药( 曲美他嗪3mg /kg) 。运动治疗组按亚极量运动方案让小鼠运动；运动联合曲美他嗪治疗组按亚极量运动方案让小鼠运动联合灌胃给药( 曲美他嗪3mg /kg)。处死动物后测定心肌梗死面积、心肌细胞、内皮细胞凋亡等指标。
（4）心肌组织病理学检查：取结扎部位以下5 ～ 6mm 心肌组织常规石蜡包埋切片，并进行HE 染色。数码相机拍摄左心室横截面切片，使用Image Pro －Plus 6． 0 图像分析系统测量各弧长、周长、面积厚度，按照公式计算梗死面积［3］，以瘢痕弧长百分数( %)= 瘢痕弧长/［( 外周长+ 内周长) /2］×100%。TTC染色法计算心肌梗死体积：将心脏从胸腔中取出后，迅速用生理盐水冲洗干净，并置于-20℃冰箱中冷冻约20分钟后取出，按短轴位将心肌切成2-3mm后的切片。将2gTTC溶解于100ml的PH7.4的1mol/L的PBS溶液中配置成TTC溶液。将心肌切片浸泡于TTC溶液中避光保存于37℃恒温箱中15分钟后，用10%甲醛溶液固定15分钟。正常心肌被染成红色，梗死心肌为白色。
（5）心肌细胞凋亡检测：采用TUNEL 法检测心肌细胞凋亡。 取结扎部位以下5 ～ 6 mm 心肌组织常规石蜡包埋切片。切片常规脱蜡至水，加入蛋白酶K工作液，室温反应15 ～ 30 min( 根据组织情况调整反应时间) ，PBS 液漂洗5 min × 2 次，浸入封闭液( 3%H2O2溶液甲醇) 室温15 ～ 25 ℃封闭10 min，PBS 液漂洗5 min × 2 次后进入标记反应。预处理好的样本PBS 液漂洗5 min × 2 次，样本周围用吸水纸吸干，每个样本滴加50 μL TdT 酶反应液，加盖玻片37 ℃避光湿润反应60 min; PBS 液漂洗5 min × 3 次，样本周围用吸水纸吸干，滴加50 μL Strepravidin － HRP 工作液，加盖玻片37 ℃避光湿润反应30 min，PBS 液漂洗5 min × 3 次，0．2%Triton X － 100 /PBS 室温反应5min; PBS 液漂洗5 min × 2 次，滴加50 μL DAB 工作液，室温显色反应10 min，PBS 液漂洗5 min × 3 次，苏木素复染，脱水、透明封片。显微镜下观察、拍照。阳性细胞显示为棕黄色。细胞凋亡指数( apoptoticindex) 的计算方法为，每张切片数5 个以上的高倍视野，不少于100 个细胞，分别计数心肌凋亡细胞数，以凋亡细胞占所计数细胞的百分比作为它们各自细胞凋亡率。
（6）内皮细胞检测 用免疫组化VIII因子检测内皮细胞的生长情况。VIII因子主要存在于血管内皮的细胞质中，因此可以作为鉴定血管内皮细胞的特异性标志[8].经VIII因子染色后的内皮细胞呈棕黄色。
（7）处理前后定期检测小鼠血清中BNP及cTNT的水平
3.2.2 技术路线
3.2.3统计学处理
计量资料以均数± 标准差( x ± s) 表示，进行正态性检验。正态分布资料，组间比One － way ANOVA 单因素方差分析，两两比较用LSD － t 检验，多组两分类资料用2 检验。应用SPSS For Windows 13。0 统计软件进行统计学分析。
3.研究计划及预期研究成果。
2015.01－2015.3  建立心梗动物模型
2015.04-2015.12  药物和运动干预
2015.01-2015.06  病理及血标本检测
2015.07-2015.12  资料整理及论文书写
预期研究成果：
1、发表高质量论文 2-3篇
2、培养硕士研究生 2-3名
研究基础
1. 本项目负责人从事心血管临床工作30多年，对心血管疾病的诊治及康复训练有丰富的临床经验。现为博士研究生导师，主要研究方向为冠心病防治与康复，作为第一作者或通讯作者在国内外已发表与冠心病相关研究论文80多篇，其中SCI收录7篇。
2. 本项目负责人所在中南大学湘雅二医院心内科和血脂与动脉粥样硬化研究所，是卫生部重点科室和湖南省重点研究所，有较好的动物试验和细胞实验条件。
3. 我们前期研究已成功建立小鼠心梗模型，已具备本实验所需的小鼠呼吸机和12跑道小鼠跑台，在硬件和技术方面能够完全胜任此项研究。
4.已发表的主要论文
1.Xiang-Ping Li, Shui-Ping Zhao, Xiang-Yu Zhang, Mei Gao, Qi-Chang Zhou. Protective effect of high density lipoprotein on endothelium-dependent vasodilatation. International Journal of Cardiology, 2000,73:231-236.
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3.Jun Yang, Xiang-Ping Li（Corresponding author）, Shui-Ping Zhao, Jiang Li. The effect of different doses of fluvastatin on inflammatory markers in the early phase of acute coronary syndrome. 2006,Clinica Chimica Acta,368:183-187.
4.Liu YX, Li XP（Corresponding author）, Peng D, Tan Z, Liu H, Qing Y, Xue Y, Shi GP. Usefulness of serum cathepsin L as an independent biomarker in patients with coronary heart disease. Am J Cardiol. 2009;103(4):476-81.
5.Li XP（Corresponding author）, Zhao SP, Qin YN. Effect of the compositie salviae dropping pill on blood lipids and large artery elasticity in patients with coronary heart disease or coronary risk factors. Heart, 2010,96:A113-A114.
6.Liao Q, Li X（Corresponding author）, Zhou S, Liu L, Zhao S, Lian Y, Dong H. Estrogen Treatment Inhibits Vascular Endothelial Senescence and Asymmetrical Dimethylarginine(ADMA) in Ovariectomized Rabbits.J Cardiovasc Pharmacol. 2011 Feb;57(2):174-82.
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中南大学湘雅二医院申请者：李向平