一、立题依据
心肌肥大是高血压等患者心脑血管事件的独立的危险因素。多种刺激如压力过负荷、神经体液因子以及心肌收缩蛋白基因突变等会致心肌细胞出现许多组织细胞形态学的适应性反应。心肌重塑是心脏对慢性压力超负荷的早期代偿性反应, 主要表现为心肌细胞肥大和细胞外基质异常。肥大特征一般表现为：1)心肌细胞体积增大；2)蛋白质合成增加；3)“胚胎期”基因再表达。初期的心肌肥大有代偿意义，不过持续性心肌肥大最终可致扩张性心肌病、心衰和猝死。目前心脏移植虽然是终末期心衰的最有效治疗方法，但这种治疗并非每个病人可以获得，而且也不适合于轻度病变的病人。目前药物治疗心衰主要通过改变神经内分泌（如：β受体阻滞剂和ACEI类药）以提高心脏收缩功能，纠正心肌细胞钙转运实现。这些方案虽可以使心功能短期升高，但心衰的5年死亡率仍然达50％[1]。目前，药物的靶向性治疗是很多疾病治疗的曙光，也是目前研究药物治疗的热点。因此阐明心肌肥大以及由心肌肥大到心力衰竭演变的分子机制对心衰防治有重要意义，心肌肥大的分子机制非常复杂，人们对心肌肥厚发生的确切分子和细胞信号转导机制仍知之甚少，我们的研究也在心肌肥大的机制方面取得了一些成绩，本文对近期的国际和我们团队的研究作一综述。
1.心肌细胞肥大的信号转导通路
不同的刺激通过激活不同的信号传感器和信号通路，从而产生不同的分子表型。心肌肥大发生中有三种跨膜信号装置起传感器作用：G蛋白偶联受体、具有酪氨酸激酶活性的生长因子受体和非受体酪氨酸激酶的细胞因子受体。心肌肥大本质是肥大刺激诱导核内基因异常表达的结果，细胞内信号转导是肥大刺激与核内基因转录活化的重要环节。不同刺激诱导的心肌肥大可能具有不同的“分子表型”，这主要取决于它们启动的信号转导途径。而且各信号通路之间相互作用相互影响。
（1）Ca2+及其依赖的信号途径
    各种肥大刺激如机械牵拉、血管紧张II(Ang II)、内皮素1(ET1)及儿茶酚胺（CA）等可激活机械敏感的钙离子通道或PLC-IP3途径使心肌细胞内浓度升高。
钙调神经磷酸酶(Calcineurin)是一种依赖钙调蛋白激活的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。细胞内钙浓度持续升高后，在钙调蛋白的作用下，Calcineurin被激活，激活的Calcineurin通过对转录因子NFAT去磷酸化，后者入核激活一系列基因的转录。可调节心脏中脑钠肽(BNP)、心房利钠肽 (ANP)、α肌球蛋白重链(αMHC和βMHC)等基因的表达，促进心肌肥大表型的再表达，抑制Calcineurin信号通路可明显抑制的心肌肥大效应[2-3]。
（2）丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径与心肌肥大
     MAPK是真核细胞中的一个重要信号系统，G蛋白藕联受体、酪氨酸激酶受体或离子通道藕联受体均可经过不同的中间环节引起MAPK的激活，激活的MAPK通过调节核内转录因子，致细胞增殖和生长反应信号转导通路。MAPK家族有三个主要成员：细胞外信号调节激酶(ERK)、应急激活蛋白激酶 (JNK)和p38激酶。心脏靶向表达ERK1/2的上游激酶MEK-1可持续激活ERK1/2，致明显的心室向心性肥厚[4]，ERK5也在心肌肥大的发展中起重要的调控作用[5]。p38在心肌肥大和心力衰竭中的作用较复杂，研究得出的结论也不一致，有的提示p38磷酸化增加导致心肌肥大[6]，有的研究则提示抑制心肌肥大[7]，我们前面的研究发现磷酸化p38表达增加时可以导致心肌肥大。这种p38活化后产生的不同作用可能是由于其不同的异构体发挥着不同的生物学功能。JNK在心肌肥大中的作用同样存在两面性[8,9]。我们近期的研究发现：蛋白酶体抑制剂也可通过调节MAPK 信号通路预防高血压心肌肥厚的发生，同时可通过抑制NF-κB 信号通路预防和逆转心肌纤维化和心肌重塑。我们的研究首次报道了蛋白酶体抑制剂MG132 可通过调节MAPK 和抑制NF-κB 预防和逆转心肌肥厚，心肌纤维化和心力衰竭。
（3）JAK-STAT信号通路与心肌肥大
     JAK1、JAK2、JAK3和Tyk2为在哺乳动物JAKs家族中发现的4种激酶。许多细胞因子及非免疫性生物化学介质如：干扰素、糖蛋白130受体家族的配体和白细胞介素-6(IL-6)都能激活JAK-STAT信号通路。这些配体与相应的受体结合导致JAKs的激活，激活的JAKs将受体上特定的酪氨酸残基磷酸化，并使其成为STATs和其它细胞内信号分子的结合位点，集聚到该位点上的STATs在JAKs的
作用下磷酸化而被激活，激活的STATs与受体分离，二聚化后转位到细胞核，从而启动相应的基因转录。研究证实，激活的STAT3可导致心肌肥大[10-11]。
（4）蛋白激酶C信号通路与心肌肥大
     PKC是丝/苏氨酸蛋白激酶家族中的一员，PKC存在于包括心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞等的心脏多种细胞中。PKC可被机械牵张、G蛋白偶联受体激动剂、生长因子和细胞因子等肥大刺激所激活，过量表达PKC可诱导显著的心肌肥大[12]。在异丙肾上腺素与苯肾上腺素 (PE)导致的肥大心肌中，PKC表达同样增加。除可直接移位入细胞核调节核内基因表达外，还可在胞浆内通过活化Raf-1，与MAPK信号途径偶联，是活化MAPK的重要机制之一。目前的研究证实，PKC是心肌肥大信号传导通路中的一个限速分子开关，是肥大信号传导的共同通路之一，在心肌肥大的发生发展中起重要作用。
（5）磷脂酰肌醇- 3激酶 (PI3K )/Akt与心肌肥大
     PI3K在调节心肌细胞生长、心肌肥大和心力衰竭的发展过程中起着重要作用[13-14]。PI3K是由调节亚基p85和催化亚基p110所组成的异二聚体。Akt是PI3K下游的重要靶基因，具有丝/苏氨酸激酶活性。Akt是与细胞生存相关的重要调节因子，Akt激活时可抗凋亡和促细胞生存。当PI3K活化后产生3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol(3,4,5)-trisphosphate，PIP3）使Akt转位到细胞膜，活化的Akt通过磷酸化作用激活其下游底物如GSK3β和 p70S6K，从而导致心肌肥大。
在caPI3K（心脏特异性表达PI3K增加）转基因小鼠的心肌组织中Akt活性增加；而在dnPI3K（PI3K基因敲除）转基因小鼠的心肌组织中Akt活性则降低[16]。心脏特异性表达caAkt的转基因小鼠可出现明显的心肌肥大和心脏功能的改变[16]。磷酸化的Akt通过下游多种途径对靶蛋白进行磷酸化而发挥抗凋亡作用，例如Akt激活IκB激酶（IKKα），导致与核因子-κB( NF-κB)结合的IκB降解, 从而使NF-κB从细胞质中释放出来进行核转位，激活其靶基因而促进细胞的存活。我们的研究发现，在缩窄主动脉诱导的肥大心肌组织中同时NF-κB活性也增加。
（6）AMPK信号通路与心肌肥大
     我们团队近年来对AMPK信号通路与心肌肥大的分子机制进行了较多的研究。AMP激活的蛋白激酶( AMP activated protein kinase, AMPK )是细胞的能量变化感受器。机体受到生理或病理刺激时, AMPK 影响糖原、脂肪酸及蛋白质代谢, 对心血管系统功能起重要调节作用。在心肌及血管平滑肌受缺血/缺氧或心血管活性物质刺激时, AMPK 激活还能通过影响细胞周期及物质代谢抑制细胞增殖, 在高血压及动脉粥样硬化的防治中起重要作用。近几年，我们的研究证实在压力负荷所致的大鼠心肌肥大模型中，观察了7周时的结果提示长期的AMPK激活可以减轻心肌肥厚，并能够改善TAC大鼠的心功能，而且，AMPK的激活可以减少蛋白的合成并能减弱压力负荷诱导的肥厚心肌的活化T细胞的核因子（NFAT）钙调神经磷酸酶和核因子KB（NF-KB）信号通路。AMPK的特异性激动剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside(AICAR)促进心肌肥厚的效果在MuRF1被沉默后会被抑制。证实了激活AMPK会增加FOXO1的转录活性并增强了下游泛素连接酶Muscle RING finger1（MuRF1）的表达，AMPK的特异性抑制剂可以抑制心肌肥厚的效应并可以改变FOXO1/MuRF1通路。在TAC大鼠的心肌中，ERK1/2、MAPK磷酸化水平显著上调，而 PPARa 蛋白水平明显下调，进一步的研究则显示AMPK通过ERK1/2通路而不是通过p38 MAPK通路增强PPARs的活性而抑制心肌肥大的。我们在AngⅡ诱导离体心肌细胞肥大的模型上观察了AICAR 对肥大心肌细胞的影响，结果表明AICAR 能减轻AngII 所引起的心肌细胞表面积的增大和［3H］-leucine 掺入率的增加，这就证实了AMPK 在抑制心肌肥大中发挥了重要作用，但在加入HO-1 的阻断剂ZnPPⅨ后，AICAR 抑制心肌细胞肥大的作用消失， 表现为心肌细胞表面积明显增大，［3H］-leucine 掺入率明显升高，与AngⅡ的诱导作用相似，这也间接证实了HO-1 在AMPK抑制心肌肥大的机制中起重要作用［13］。
（7）炎症、NF-κB信号通路与心肌肥大
     最近的研究提示NF-κB信号通路可能在心肌肥大的发生发展中起着重要作用[17-18]。细胞在静息状态下，胞质中的NF-κB二聚体p50/p65与IκB结合成三聚体，使p50/p65不能核易位。当细胞受到细胞外信号刺激时，引起IκBa磷酸化，磷酸化的IκBa再被泛素化后在26S蛋白水解酶复合体作用下降解，从而使NF-κB二聚体（p50/p65）与IκB分离，而被释放的NF-κB二聚体（p50/p65）则进行核易位，与基因上的IκB位点发生特异性结合，从而发挥调节细胞功能的作用。研究证实NF-κB的激活是心肌细胞肥大所必需的。在体外培养的大鼠左室心肌细胞中，NF-κB及其核转录活性可被肥大激动剂包括：苯肾上腺素、内皮素-1和Ang-II所激活，抑制NF-κB的活性可以使肥大刺激剂诱导的胚胎基因ANP的表达和心肌细胞的增大效应消失，而表达过量的NF-κB家族成员可以诱导胚胎基因ANP的过表达[17-18]。而在体心肌细胞中也得出相同的结论，NF-κB定向抑制剂足以减弱Ang-II和去甲肾上腺素诱导的心肌肥大[19]。用直接基因递送sh-p65RNA(短发夹RNA)（沉默NF-ΚB）的方法直接抑制NF-κB活性，或用NF-κB的特异性抑制剂PDCT处理NF-κB p65基因敲除鼠，结果均证实可以逆转心肌肥大[17]。在转基因的心肌肥大动物模型中，IκB 基因的显性负相表达引起NF-κB 的活性的抑制，从而使肥大心肌过量表达的重组胰岛素样生长因子减少[18]。
传统观点认为，NF-κB信号通路主要作为介导炎症反应的细胞内信号转导通路。近期有特别令人关注的研究提示，炎症细胞因子(如：肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素-1( IL-1))等可能是介导NF-κB与心肌肥大相关的介质。许多研究证实心血管病是慢性炎症性疾病，他汀类药物能预防和治疗心脑血管疾病就是一个佐证。在体外培养的成纤维细胞中加入TNFα和IL-1β，可诱导基质金属蛋白（MMPs）表达增加，通过抑制NF-κB信号通路，可抑制TNFα的这种作用；在培养的原代心肌细胞中加入IL-1β或TNFα[19]，可诱导心肌细胞肥大，使心肌肥大的标志物如BNP和ANP等的表达明显增加。在动物实验中也证实了心衰与炎症的关系：压力负荷所致的大鼠心肌肥大模型中，心肌的IL-1β表达增加，进展到心衰时IL-1β表达进一步上升；过量表达hIL-lα的转基因小鼠，其心肌细胞肥大，同时ANP和β-MHC的表达增加。过度表达TNF-α的转基因小鼠的研究发现TNF-α的表达量升高可造成心肌细胞外基质重构，导致心肌细胞肥大，左室扩张，收缩功能受损，最终发展为心力衰竭。与野生型对照小鼠相比，TNF-α缺陷小鼠明显减弱对慢性缺氧诱导右心室心肌肥大的反应，TNF-α基因敲除鼠的心肌凋亡、肥大、炎症反应和纤维化显著低，且能减少心肌基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的活性和改善心功能[20-21]。这些研究提示炎症细胞因子参与了心肌细胞肥大的调控过程，与NF-κB信号通路密切相关。
2、我们的设想
已经有研究证实曲美他嗪在缺血性心肌病中的应用。1990年，Brottier 等人首次报道了曲美他嗪治疗心衰患者有效性的证据[22] [12]。在射血分数明显降低的缺血性心肌病患者，研究者们完成了双盲的安慰剂对照试验，评价标准治疗基础上加用曲美他嗪60mg的疗效。经过6个月的治疗后，发现接受曲美他嗪治疗的患者，心绞痛症状减轻，呼吸困难改善，射血分数增加，心脏容积减少。Belardinelli和Purcaro等[23] [14]发现曲美他嗪能够改善慢性心肌功能障碍患者的机械收缩效率。Fragasso 更新的研究中在随机双盲安慰剂对照的试验中等人[24] [17]在患有糖尿病合并缺血后心肌病患者中也发现了与上述类似的试验结果：曲美他嗪能够不断提高患者的运动耐量，改善患者的左室功能。此外，还首次发现曲美他嗪的有益作用与内皮功能。Di Napoli[25]等的研究也是首个通过测定C反应蛋白（CRP）评价曲美他嗪的潜在抗炎作用的研究。他们的研究发现曲美他嗪组18个月治疗中CRP水平一直稳定，而对照组CRP水平不断进展并明显增加。这些新的研究数据提示，曲美他嗪可能抑制了炎症过程。但确切分子机制尚不清楚，目前国内外也未查到相关报道。我们推测，曲美他嗪抑制炎症及心肌肥大可能通过NF-κB信号通路来实现的。为证实我们的推测，设计了以下几方面实验：（1）在细胞水平下阐明曲美他嗪抑制心肌肥大的机制中NF-κB信号通路的作用，我们以AngII诱导心肌肥大为体外模型，分析NF-κB的DNA结合活性。此外，我们将IκB-α siRNA（NF-κB活性的抑制物）转染到心肌细胞，观察抑制了NF-κB活化对曲美他嗪抑制心肌肥大这一作用的影响。（2）既然IκB-α siRNA转染后曲美他嗪的抑制心肌细胞肥大作用被部分阻断，说明还存在其他的信号通路，为此，我们进一步在细胞水平阐明曲美他嗪抑制心肌肥大的机制中PI3K/Akt信号通路的作用，以AngII诱导心肌肥大为体外模型，分析PI3K和Akt磷酸化情况。此外，我们分别用Akt-siRNA质粒和PI3K- siRNA质粒处理肥大的心肌细胞，通过评价曲美他嗪对心脏大小、心功能、心肌细胞形态、蛋白质合成和胚胎期基因表达的影响，观察抑制了PI3K和Akt活化对曲美他嗪抑制心肌肥大作用的影响。（3）为阐明在整体条件下，曲美他嗪抑制心肌肥大的机制中NF-κB信号通路PI3K/Akt信号通路是否起着关键作用，我们以缩窄SD大鼠升主动脉诱导的心肌肥大为模型，分析PI3K/Akt蛋白水平和NF-κB的DNA结合活性。此外，为了提高活体心肌中转染效率，采用腺病毒为载体。将IκBα或Akt重组腺病毒转染到大鼠心肌组织中，通过评价曲美他嗪对心脏大小、心功能、心肌细胞形态、蛋白质合成和胚胎期基因表达的影响，观察在体水平抑制了NF-κB活性对曲美他嗪抑制心肌肥大这一作用的影响。 3、本研究的创新之处
目前众多研究证实心血管病实质是慢性炎症性疾病，故对从不同的靶点起抗炎作用的药物进行研究非常有价值。有研究[20]发现曲美他嗪有抗炎作用，但其机制尚不明确，也未查阅到相关机制的研究。既然曲美他嗪有抗炎作用，而且可能是通过抑制NF-κB和PI3K/Akt信号通路，而炎症因子、NF-κB和PI3K/Akt信号通路在心肌肥大中的作用已经被大量的研究证实。本研究设想：曲美他嗪能否抑制心肌肥大？曲美他嗪抑制心肌肥大的药物靶点又是什么呢？本研究就是为了回答这一问题展开的。我们搜索目前文献，未查到相关报道，为进一步筛选曲美他嗪调控心肌肥大的药物作用靶点，为心肌肥大的防治提供新的策略，我们非常期望能够得到资助。
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二、研究目标与研究内容
研究目标
在前期实验的基础上，通过建立AngII诱导的心肌细胞模型和主动脉缩窄导致的SD大鼠心肌肥大模型，用曲美他嗪干预后，观察其对在体心肌肥大的抑制作用，进一步明确曲美他嗪抑制心肌肥大的分子机制，采用siRNA技术和腺病毒重组技术，分别阻断肥大心肌细胞或大鼠心肌的PI3K、Akt和NF-κB活性后，观察其对曲美他嗪抑制心肌肥大作用产生的影响，从而筛选出曲美他嗪抑制心肌肥大的药物靶点。
研究内容
（1）在细胞水平阐明曲美他嗪抑制心肌肥大的机制中NF-κB信号通路的作用，我们以AngII诱导心肌肥大为体外模型，分析NF-κB的DNA结合活性。此外，我们将IκB-α siRNA转染到心肌细胞，观察抑制了NF-κB活化对曲美他嗪抑制心肌肥大这一作用的影响
（2）我们进一步在细胞水平阐明曲美他嗪抑制心肌肥大的机制中PI3K/Akt信号通路的作用，以AngII诱导心肌肥大为体外模型，分析PI3K和Akt磷酸化情况。此外，我们分别用Akt-siRNA质粒和PI3K- siRNA质粒处理肥大的心肌细胞，通过评价曲美他嗪对心脏大小、心功能、心肌细胞形态、蛋白质合成和胚胎期基因表达的影响，观察抑制了PI3K和Akt活化对曲美他嗪抑制心肌肥大作用的影响。
（3）为阐明在整体条件下，曲美他嗪抑制心肌肥大的机制中NF-κB信号通路PI3K/Akt信号通路是否起着关键作用，我们以缩窄SD大鼠升主动脉诱导的心肌肥大为模型，分析PI3K/Akt蛋白水平和NF-κB的DNA结合活性。此外，为了提高活体心肌中转染效率，采用腺病毒为载体。将IκBα或Akt重组腺病毒转染到大鼠心肌组织中，通过评价曲美他嗪对心脏大小、心功能、心肌细胞形态、蛋白质合成和胚胎期基因表达的影响，观察在体水平抑制了NF-κB活性对曲美他嗪抑制心肌肥大这一作用的影响。 三、研究方案（包括研究对象、研究方法、技术路线、统计方法等）
研究对象方法
（1）心肌细胞肥大模型构建，取1-3天新生大鼠的心肌行原代心肌细胞培养，本方法已经非常熟练掌握。利用AngП诱导心肌细胞肥大。在前期研究中已经完成。
（2）大鼠主动脉缩窄模型的建立，参考我们既往的研究。
（3）构建Akt和PI3K- siRNA质粒（由广州锐博生物科技有限公司），分别转染心肌细胞，利用流式细胞术检测观察其转染效率，观察转染上述基因后曲美他嗪抑制心肌肥大的变化。
（4）为了提高活体心肌的转染效率，采用腺病毒为载体，重组IκBα和Akt腺病毒（通过北京宝赛生物技术有限公司购买）。将重组IκBα或Akt腺病毒和安慰剂注射入不同组别的SD大鼠心脏，注射方法参考现有的方法[Proc. Natl. Acad. Sci.1998;95: 5251–5256; Circulation. 2004;110: 3435-3443]。
（5）灌胃2周和4周后，观察曲美他嗪对不同组别鼠心肌肥大的作用，麻醉后有技术员行心脏多普勒超声心动图测室壁厚度及心功能，次日麻醉后推氯化钾处死动物取出心脏称重，部分鼠心脏沿二尖瓣切开做冰冻切片，HE染色，部分鼠心脏于－80℃保存备用。
（6）通过图像分析测细胞面积及同位素 3H 亮氨酸掺入率，PCR 检测心肌细胞胚胎基因再表达了解心肌细胞肥大情况，同位素3H 亮氨酸掺入率参照我们以前做法进行。
（7）Real-time PCR 和Western bloting 检测胚胎基因ANP、BNP和PI3K、Akt等表达，EMSA检测NF-κB的活性。利用流式细胞术检测观察IκBα-siRNA、PI3K-siRNA 和Akt-siRNA转染效率。
（8）统计学分析：所有数据采用 SPSS11.0 统计软件进行分析。
技术路线（线路图见下页
构建AngП诱导的心肌细胞肥大模型，了解曲美他嗪是否是通过NF-κB信号途径和PI3K/Akt信号途径抑制心肌肥大，前者在前期实验已经证实，通过建立主动脉缩窄（AB）导致的大鼠心肌肥大模型，用曲美他嗪干预后，观察其对在体心肌肥大的抑制作用。利用siRNA，构建不同目的基因的质粒和腺病毒，按不同分组分别处理细胞和动物，同时予曲美他嗪或安慰剂干预，通过心脏彩色多普勒、Real-time PCR 、Western blot、EMSA、图像分析测细胞面积及同位素 [3H]亮氨酸掺入率等技术观察曲美他嗪处理不同组别动物后心肌肥大的变化。