曲美他嗪通过抑制线粒体Ca2+超载诱发的氧化应激及凋亡防治慢性心力衰竭的机制研究
立论依据
　　心力衰竭是各种病因所致心脏病的终末阶段。其主要病理生理问题是原发性心肌损害或心肌收缩期或舒张期负荷过重导致心肌细胞数量减少和心室舒缩功能低下，同时伴有神经内分泌系统过度激活等等，最终导致心肌细胞凋亡、细胞外基质重塑。目前，尽管应用β受体阻滞剂、血管紧张素酶抑制剂以及螺内酯等药物干预能够延缓病人的寿命及降低死亡率，但是绝大部分患者仍然无法控制病情的持续发展而走向终末期心力衰竭，因此目前亟待发现新的有效治疗方法。
我们前期研究以普通C57BL/6小鼠皮下植入异丙肾上腺素（Iso，30mg/kg/d，14天）渗透性微泵，建立慢性心力衰竭模型，给予曲美他嗪、β受体阻断剂或二者联合干预，发现曲美他嗪能显著改善心力衰竭小鼠的舒缩功能，同时发现曲美他嗪可通过抑制内质网应激抵抗心肌细胞损害。本项目在前期研究的基础上，深入探讨曲美他嗪治疗心力衰竭的作用机制，为其治疗心力衰竭提供理论依据。
1.钙超载与心力衰竭
　　钙离子在维持细胞正常结构和功能方面起重要作用1。正常时细胞通过一系列转运机制维持细胞内低钙状态，但一些有害因素可引起钙平衡系统功能失调，钙分布紊乱，导致细胞内钙浓度异常性升高，即钙超载。钙超载时可损伤细胞膜和线粒体，引起细胞损伤，从而加速了不可逆转的细胞死亡2。
心力衰竭时，由于交感神经系统过度激活，引起心肌细胞膜上的L型钙通道（LTCC）开放增加，钠钙交换体（NCX）表达增多，导致胞外钙内流增多；内质网膜上的斯里兰卡肉桂碱受体（RyR2）过磷酸化且Ca2+-ATP酶2a（SERCA2a）的表达和活性下降，导致Ca2+从肌浆网释放增多而泵入减少，最终引起细胞浆钙超载3, 4。钙超载可引起心肌细胞的舒缩功能异常，并通过影响线粒体功能和酶活性而损伤细胞。近年来，研究证实钙超载亦可引发氧化应激5，从而加剧细胞损害6。因此，抑制钙超载可减轻线粒体损害，抑制细胞凋亡。
2．钙超载和氧化应激
　　氧化应激是指机体组织或细胞内氧自由基增多和(或)清除能力降低导致活性氧（reactive oxygen species; ROS）在体内或细胞内蓄积而引起的氧化损伤过程。机体抗氧化防御机制包括一系列的抗氧化酶和抗氧化物质构成的氧化还原网络，酶性抗氧化物质包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)，过氧化氢酶，谷胱甘肽过氧化物酶以及谷胱甘肽还原酶，非酶抗氧化剂包括氧化维生素，泛醌还原物，过渡金属蛋白等，各种抗氧化物可协同清除ROS，自由基，从而减轻和消除氧化损伤。
实验表明，线粒体是细胞内ROS产生的主要部位。通常情况下，大部分电子以NADH的形式传送给电子传递连复合物I，少量电子以FADH2形式提供给电子传递链复合物II。电子然后以辅酶Q的形式传递给复合物III。最后，电子由细胞色素c从复合物III传递给复合物IV，最终形成水。复合物I和III是形成超氧化物的主要场所7。线粒体内大量ROS聚集可直接引起线粒体损伤，细胞能量供应匮乏，进一步加剧细胞凋亡。
研究证实，胞浆内钙超载可促进钙离子涌入到细胞核和线粒体。在胞核，钙离子可调节凋亡基因的转录和核酸酶活性，导致细胞凋亡；而线粒体钙超载，可打乱电子传递链，从而加剧ROS的产生8。因此，在交感神经高度兴奋的心衰状态下，胞浆内钙超载可引起线粒体内钙超载，从而导致氧化应激，最终诱发细胞凋亡。高浓度的ROS可触发细胞内的氧化应激反应，直接作用于蛋白质，脂类和DNA，造成氧化损伤及细胞凋亡，引起并推动疾病进展9。我们近期的研究证明，曲美他嗪可减轻心肌细胞内钙超载（见研究基础），这驱使我们深入研究曲美他嗪发挥心肌保护的新机制。因此，我们设想曲美他嗪可以抑制钙超载诱发的线粒体ROS。
3．曲美他嗪与钙超载
　　曲美他嗪已被证实能够通过调控代谢途径，作为抗心肌缺血或细胞保护剂，有效地治疗慢性稳定型心绞痛和左心室功能障碍10。曲美他嗪能够抑制长链3-酮酰辅酶A硫解酶(3-KAT)在心肌细胞中的β-氧化途径，发挥其关键的药理作用11。这将使得心脏代谢由游离脂肪酸氧化转为葡萄糖氧化，而后者是一种在耗氧量和能量（三磷酸腺苷）生产方面更有效的代谢途径。有研究证实，曲美他嗪可缓解心肌功能障碍，因为它能够增加葡萄糖氧化，同时减少游离脂肪酸氧化，从而保护缺血心脏12。
近年来研究发现，曲美他嗪有不依赖于代谢调控的其他作用机制。研究表明曲美他嗪可以通过调节氧化应激改善内皮细胞功能13，也可调节线粒体功能发挥心肌保护作用14，从而防治慢性心力衰竭；曲美他嗪通过NADPH氧化酶-活性氧ROS-CTGF途径抑制血管紧张素II引起的心肌纤维化15。可是，曲美他嗪抑制氧化应激的机制却鲜有报道。尚不清楚曲美他嗪是通过直接还是间接作用而调节线粒体内氧化应激反应。我们前期的研究结果表明曲美他嗪可通过抑制异丙肾上腺素（isoproterenol；Iso）引起的心肌细胞内钙超载。
于是，我们提出假设，曲美他嗪通过抑制钙超载-氧化应激-凋亡通路从而防治慢性心力衰竭。
参考文献
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10.Szwed H, Sadowski Z, Elikowski W, Koronkiewicz A, Mamcarz A, Orszulak W, Skibinska E, Szymczak K, Swiatek J, Winter M. Combination treatment in stable effort angina using trimetazidine and metoprolol: Results of a randomized, double-blind, multicentre study (trimpol ii). Trimetazidine in poland. Eur Heart J. 2001;22:2267-2274
11.Kantor PF, Lucien A, Kozak R, Lopaschuk GD. The antianginal drug trimetazidine shifts cardiac energy metabolism from fatty acid oxidation to glucose oxidation by inhibiting mitochondrial long-chain 3-ketoacyl coenzyme a thiolase. Circ Res. 2000;86:580-588
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13.Belardinelli R, Solenghi M, Volpe L, Purcaro A. Trimetazidine improves endothelial dysfunction in chronic heart failure: An antioxidant effect. Eur Heart J. 2007;28:1102-1108
14.Dedkova EN, Seidlmayer LK, Blatter LA. Mitochondria-mediated cardioprotection by trimetazidine in rabbit heart failure. J Mol Cell Cardiol. 2013;59:41-54
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三、研究内容及研究方案
1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题；
研究目标：
在前期的在体模型中，我们发现曲美他嗪可显著改善Iso引起的心脏舒缩功能紊乱，防治慢性心衰；并且我们证实曲美他嗪可通过抑制内质网应激发挥心肌保护作用。本研究旨在揭示曲美他嗪减轻心肌细胞内Ca2+超载，调控慢性心衰中钙超载引发的氧化应激和线粒体损伤，阐释曲美他嗪治疗慢性心衰重要病理生理机制，并提供新的治疗靶点及方案。为此我们确定了2个具体的研究目标：
1.体外确证曲美他嗪对慢性心衰中心肌内钙超载（已完成）和氧化应激的调控作用；
2.体内确证曲美他嗪通过调控细胞内钙超载而抑制氧化应激反应。
研究内容：
近年来我们和其他一些研究小组在不同的心力衰竭动物模型中均发现线粒体内氧化应激反应及其相关凋亡通路被激活，而抑制线粒体氧化应激反应、恢复线粒体功能成为心力衰竭潜在的治疗靶点。大量研究显示曲美他嗪能通过改善线粒体内氧化应激反应而保护心血管系统。本项目将在体内和体外证实曲美他嗪对线粒体氧化应激反应的作用及机制，深入探讨其治疗心力衰竭的作用机制。我们将从以下几方面实现本项目的研究目标：
1．在普通C57BL/6小鼠皮下植入异丙肾上腺素（Iso，30mg/kg/d，14天）渗透性微泵，建立慢性心力衰竭模型，给予曲美他嗪（TMZ）、β受体阻断剂(美托洛尔；Meto)或二者联合干预，研究曲美他嗪对氧化应激和线粒体损伤的影响，明确其对心力衰竭的防治作用。
2．通过心肌细胞系和乳鼠原代细胞体外培养方法，进一步研究曲美他嗪对抗线粒体氧化应激及其损伤的分子机制，明确曲美他嗪对维持钙离子稳态和恢复线粒体功能的作用机制。
总之，通过本项目的研究将深刻阐明曲美他嗪在心力衰竭中抑制线粒体氧化应激的作用机理，这将对其治疗心力衰竭提供理论依据。
拟解决的关键问题：
（1）通过本项目研究我们可以确定曲美他嗪是否可以抑制异丙肾上腺素（Iso）诱导的氧化应激反应。
（2）通过对心肌细胞中钙超载、氧化应激反应及其相关的凋亡通路的研究，阐明曲美他嗪在慢性心衰治疗中新的作用机制。
2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析、统计学方法；
动物模型建立：
1）普通C57BL/6小鼠皮下植入异丙肾上腺素（Iso，30mg/kg/d，14天）渗透性微泵，建立心力衰竭模型（已完成）。
2）动物分组：
control组（空白对照）
Iso组
Iso+TMZ组（曲美他嗪；20mg/kg/d，灌胃）
Iso+Meto组（美托洛尔30mg/kg/d，灌胃）
Iso+TMZ+Meto组
（1）在上述动物模型中应用高频超声和Millar导管系统检测动物心脏功能，研究曲美他嗪对心肌肥大心力衰竭的心脏收缩和舒张功能的保护作用（已完成）。
（2）在上述动物模型中，实验终点取动物心脏标本，测量心脏体重比值评估小鼠心肌肥大程度，用组织学方法观察心肌组织形态、细胞大小，研究曲美他嗪对心肌肥大的改善作用（已完成）。
（3）心肌细胞凋亡的检测，研究曲美他嗪对心肌细胞凋亡的抑制作用及机制：
①在上述动物模型中，用TUNEL方法检测心肌细胞凋亡（已完成）；
②Western Blots检测线粒体凋亡通路相关蛋白（caspase-3/9等）表达；
③ELISA检测组织中caspase-3/9的活性。
（4）氧化应激检测指标：
①常规冰冻切片心肌组织，与超氧化物阴离子荧光探针（二氢乙啶，Dihydroethidium, DHE)避光孵育，检测ROS，荧光显微镜采集图片，软件计数；
②组织中过氧化氢（H2O2）水平利用Hydrogen Peroxide Assay Kit试剂盒（碧云天）进行检测：心脏组织进行匀浆后，加入过氧化氢检测试剂，孵育后，用酶标仪测定在560nm下吸光值；
③丙二醛（MDA）水平采用特异性试剂盒（碧云天）进行检测：心脏组织进行匀浆裂解后，加入相应检测试剂，孵育后，用酶标仪测定在532nm下吸光值。
④SOD不同亚型的表达量：总SOD检测试剂盒（碧云天）检测组织裂解液中SOD的表达；western blotting检测SOD1和SOD2的表达变化。
（5）线粒体损伤检测指标：
①电镜检测组织切片中线粒体的形态学；
②western-blot检测解耦连蛋白（uncoupling proteins; UCPs）表达；
③ATP检测试剂盒（碧云天）检测ATP合成：组织裂解后，加入ATP工作液，后用荧光光度计检测；
④罗丹明123检测线粒体膜通透性转换孔（MPTP）开放性：组织切片，孵育罗丹明123探针后，在荧光显微镜下观察。
⑤JC-1试剂盒（碧云天）检测线粒体跨膜电位：组织切片，经过相应处理后，孵育JC-1探针，后在荧光显微镜下观察（用红色和绿色荧光观察）。
（6）钙离子相关通道检测：western-blot检测Ca2+-ATP酶2a（SERCA2a）和斯里兰卡肉桂碱受体（RyR2）的表达。
体外检测指标：
1）细胞培养：采用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养H9c2心肌细胞系和原代心肌细胞。
原代心肌细胞培养：无菌条件下开胸取出SD乳鼠（1-3d）心脏，剪碎1-3mm3大小，以0.08%胰蛋白酶消化5min左右，10%胎牛血清培养基终止消化，反复数次，直至碎片完全消化。将细胞以培养基悬浮，收集于培养瓶中，差速贴壁60min后，吸取未贴壁细胞至新培养瓶中。心肌细胞培养48h后，加入0.1mmol/L的5-BrdU，以抑制非心肌细胞的生长。镜下观察细胞跳动及免疫组化α-actin鉴定心肌细胞。
2）细胞分组：
(1).探究曲美他嗪TMZ（20 μmol/L）对Iso（异丙肾上腺素；10 μmol/L）引起的心肌细胞损伤的保护作用及机制，加入β受体拮抗剂Meto（美托洛尔；20 μmol/L）做对照：
Control组
Vehical组
Iso组
Iso+TMZ组
Iso+Meto组
Iso+ TMZ+ Meto组
TMZ组
Meto组
(2).探究曲美他嗪是否可以抑制毒胡萝卜素（TG，钙超载诱导剂；0.5 μg/mL）引起的钙超载：并加入钙离子螯合剂（BAPTA；20 μmol/L）做对照，进一步证明曲美他嗪是否可以逆转钙超载：
Control组
Vehical组
TG组
TG+TMZ组
TG+BAPTA组
TMZ组
BAPTA组
在上述细胞实验中，
①细胞损伤检测指标：
a.TUNEL试剂盒（Roche，USA）：利用免疫荧光或化学技术检测细胞凋亡；
b.Annexin V/PI双染试剂盒（南京凯基）：利用流式细胞仪检测细胞凋亡；
c.ELISA试剂盒检测caspase-3/9活性。
②氧化应激检测指标，来研究曲美他嗪对心肌氧化应激的抑制作用：

a.采用DCF探针检测ROS含量；
b.过氧化氢（H2O2）水平利用Hydrogen Peroxide Assay Kit试剂盒（碧云天）进行检测；
c．使用碧云天试剂盒检测MDA水平；
d.SOD不同亚型的表达量：总SOD检测试剂盒（碧云天）检测细胞裂解液中SOD的表达；western-blot检测SOD1和SOD2的表达变化。
③线粒体损伤检测指标：
a. 电镜检测细胞固定后线粒体的形态学；
b. western-blot检测解耦连蛋白（uncoupling proteins; UCPs）表达
c. ATP检测试剂盒（碧云天）检测ATP合成：细胞裂解后，加入ATP工作液，后用荧光光度计检测；
d. 罗丹明123检测线粒体膜通透性转换孔（MPTP）开放性：孵育罗丹明123探针后，在荧光显微镜下观察。
e. JC-1试剂盒（碧云天）检测线粒体跨膜电位：孵育JC-1探针，后在荧光显微镜下观察（用红色和绿色荧光观察）。
④检测细胞内Ca2+浓度、SERCA及RyR2表达等与钙超载相关的指标：
a.胞内Ca2+浓度使用Fluo-3AM试剂盒（Invitrogen）；
b.用Western Blots检测SERCA2a和RyR2表达。
可行性分析：
（1）从研究工作基础看：
①申请者近年来主持及参与多项国家和省部级课题的研究工作，受到严格而系统的科研工作训练，熟练掌握细胞培养、PCR、Western Blot、免疫组化、基因克隆、病毒包装等实验技术；能够独立完成从分子生物学水平、细胞水平到动物模型，及后续病理研究等一系列的科研操作，并作出了突出的成绩，因此具备完成本项目的能力和实力。
②有相应的工作基础：申请者作为国家自然科学基金和相关项目的负责人或主要参与者，在高血压及糖尿病心肌纤维化研究中，有创新性研究工作，已经发表了一些相关论文。糖尿病心肌病的研究工作也正在整理资料，近期将完成研究论文。本项目的相关研究工作也已经取得了初步的研究结果，证明曲美他嗪可以通过抑制内质网应激防治慢性心力衰竭，并且可以抑制心肌细胞内钙超载。
③本项目所涉及的分子生物学技术大部分系本研究中心日常研究方法，部分内容涉及新的方法也均有可靠的技术和条件支持，并能保证在我们的研究中心完成。
（2）从实验条件看：本项目将在华中科技大学同济医学院附属同济医院高血压研究所暨基因治疗研究中心完成。本研究所有实验室面积超过620平方米，装备有完善的细胞和分子生物学研究设备、膜片钳和大小动物血流动力学和血压（有创和无创）检测等设备，还装备有HPLC-荧光和紫外光检测器、高速离心机和Beckman液闪仪等，装备有遗传学研究技术平台（包括ABI基因测序仪、7900基因分析仪）等，总价值超过1200万元；同济医院和医学院均有多台流式细胞仪、共聚焦显微镜等。总之，实验条件能够满足本项目研究的需要。
（3）研究人员素质：本高血压研究所在汪道文教授的带领下，已经形成了较强的基础研究的科研队伍。研究室负责人在美国从事分子生物研究4年，回国后连续获得国家自然科学基金资助，在7项国家自然科学基金（包括两个重点项目）的支持下，对心血管疾病进行了系列研究，并且形成了鲜明的特色、建立了研究平台和组织了相关的研究团队。实验室内除兼职人员外，还有专职研究人员3人，博士生、博士后人员及硕士研究生30余人。实验室内有规范的管理和良好的科研研究训练，因此从人员素质方面能保证项目的完成。
（4）项目依托执行单位的支持：本项目获得资助后，同济医院在实验条件、学科建设和人员、实验室面积等方面给予强有力的支持。
基于上述分析，实现本项目的目标是完全可行的。如果本项目获得资助，我们在人力、物力及技术条件等方面都能保证本项目按期或提前完成，取得重要研究成果。
3.研究计划及预期研究成果。
研究计划：
本项目设计内容两年内完成：
2015年4月-2015年12月：完善动物实验中线粒体氧化应激及损伤的相关检测。
2016年1月-2016年12月：体外研究证实曲美他嗪通过抑制钙超载-氧化应激发挥心肌细胞的保护作用。
2017年1月-2017年4月：进一步完善各项工作，全面总结研究结果，完成论文，并向写出书面报告。
预期研究成果：
争取发表研究论文1-2篇，其中一篇SCI，为曲美他嗪治疗慢性心力衰竭提供理论依据。
四、研究基础
（申请者与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩，申请者已具备的实验条件、尚缺少的实验条件和拟解决的途径）
1.工作基础
1）申请者的研究工作积累和成绩：
近年来承担课题：
1．重组腺相关病毒介导的人核心蛋白聚糖基因预防和治疗心血管系统器官纤维化的研究(批准号30871068)国家自然科学基金（项目负责人）。30万元。（2009.1～2011.12）
2．HSG诱导血管平滑肌细胞调亡和抑制增殖的功能序列和肽研究(批准号30872714) 国家自然科学基金（排名第2）。30万元。（2009.1～2011.12）
3．“十二五”国家科技支撑计划项目《静脉血栓栓塞症早期诊断及防治新策略
的研究》（参加单位负责人）。14万元。（2012.8～2013.12）
4．曲美他嗪通过抑制心肌细胞内质网应激防治慢性心力衰竭。中国健康促进基金会主办、施维雅公司资助的《心脏代谢治疗药物研究基金》（项目负责人）。5万元。（2013.5～2015.4）
5．人核心蛋白聚糖基因对2型糖尿病微血管损伤的保护作用。武汉市科技局课题（批准号2014060101010037）（项目负责人）。15万元。（2014.1～2015.12）
近年来发表的论文：
1. Chen FQ, Chen C, Yang SL, Gong W, Wang Y, Cianflone K, Tang JR (同等通讯作者), Wang DD. Let-7b inhibits human cancer phenotype by targeting cytochrome P450 epoxygenase 2J2. PLOS one 2012, 7(6): e39197 (1-12)
2. Yan W, Wang P, Zhao CX, Tang J, Xiao X, Wang DW. Decorin gene delivery inhibits cardiac fibrosis in spontaneously hypertensive rats by modulation of transforming growth factor-beta/Smad and p38 mitogen-activated protein kinase signaling pathways. Hum Gene Ther. 2009 ，20(10):1190-1200
3. Wang Q, Ding H, Tang JR (同等第1作者), Zhang L, Xu YJ, Yan JT, Wang W, Hui RT, Wang CY, Wang DW. C-reactive protein polymorphisms and genetic susceptibility to ischemic stroke and hemorrhagic stroke in the Chinese Han population. Acta Pharmacol Sin. 2009，30(3):291-298
4. Huang XY, HOU LB, Tang JR（通讯作者）, Zhang YM, Chen FQ, Wang DW. Central nervous system toxicity of sodium nitroprusside in treatment of patients with aortic dissection. J Huazhong Univ Sci Technol〔Med Sci〕.2012，32(6):927-930
5.唐家荣,晏小妮,周昌清,倪黎,汪道文.替米沙坦对腹主动脉缩窄大鼠内质网应激相关的心肌细胞调亡的影响.中华心血管病杂志,2008,36:838－842
6.严方涛，邓小艳，杨蕾，陈复琼，唐家荣（通讯作者）.112例难治性高血压临床分析.临床内科杂志，2012，29（4）：269－271
7.陈复琼，梁华荣，唐家荣（通讯作者），黄雪渊，张艳梅. 麝香保心丸对高血压左心室肥厚患者的辅助治疗作用. 中西医结合心脑血管病杂志，2012，10（5）：513－514
8.陈复琼，梁华荣，唐家荣（通讯作者），黄雪渊，张艳梅.麝香保心丸辅助
治疗逆转高血压左心室肥厚及舒张功能障碍的研究.中西医结合心脑血管病杂志，
2011，9（9）：1027～1028
9.邵娇梅、刘玉涛、唐家荣（通讯作者）.溶血反应对高血压患者肾素-血管紧张素-醛固酮系统检测的影响. 临床内科杂志，2013，30（1）：18－19
2）前期相关工作基础：
①曲美他嗪抑制异丙肾上腺素（Iso）引起的心力衰竭
动物模型建立：普通C57BL/6小鼠皮下植入异丙肾上腺素（Iso，30mg/kg/d，14天）渗透性微泵，建立心力衰竭模型；
1.在上述动物模型中应用高频超声检测动物心脏功能，研究曲美他嗪（TMZ）对心肌肥大心力衰竭的心脏收缩和舒张功能的保护作用。
*p<0.05 Saline vs. Iso; #p<0.05 vs. Iso
　　左室舒张期内径（Left Ventricular Internal Dimension， diastole，LVID;d）、左室收缩期内径（Left Ventricular Internal Dimension，systole，LVID;s）、左室后壁舒张期厚度（Left Ventricular Posterior Wall，diastole，LVPW;d）、左室后壁收缩期厚度（Left Ventricular Posterior Wall，systole， LVPW;s）、左室前壁舒张期厚度（Interventricular Septum，diastole，IVS;d）、左室前壁收缩期厚度（Interventricular Septum，systole，IVS;s）、射血分数(Ejection Fraction，EF%)以及缩短分数（Fractional Shortening，FS%）。
小结：小鼠动物模型的心脏超声结果表明：Iso干预后，EF%和FS%都明显降低，且心室各壁厚度增加，提示小鼠心力衰竭造模成功；单药（TMZ/Meto组）或双药（TMZ+Meto组）治疗后，以上数值恢复到正常水平，提示TMZ能够防治心力衰竭。
2.在上述动物模型中应用Millar导管系统检测动物心脏功能，进一步研究曲美他嗪(TMZ)对心力衰竭小鼠心脏收缩和舒张功能的保护作用。
*p<0.05 Saline vs. Iso; #p<0.05 vs. Iso
心率（HR），左室舒张末压（LV end-diastolic pressure, LVEDP；Ped），左室压力最大上升和下降速率（±dP/dt max）。
小结：小鼠动物模型的Millar导管结果表明：Iso干预后，Ped增加，dp/dtmax和dp/dtmin下降均表明心肌舒缩能力下降，提示心力衰竭；单药（TMZ/Meto组）或双药（TMZ+Meto组）治疗后，以上数值恢复到正常水平，提示TMZ减轻心力衰竭。
3.在上述动物模型中，Western Blots检测内质网应激反应相关蛋白表达，来研究曲美他嗪对心肌细胞内质网应激的抑制作用。
小结：小鼠动物模型的心脏标本的western blotting结果表明：Iso干预后，内质网应激通路相关蛋白表达上调；单药（TMZ/Meto组）或双药（TMZ+Meto组）治疗后，可抑制内质网应激相关蛋白的表达。提示：TMZ可通过调节内质网应激发挥心肌保护作用。
4.曲美他嗪可抑制心肌细胞内Iso引起的钙超载。
*p<0.05 vs.con; #p<0.05 vs. Iso
小结：在H9c2细胞中，用Iso刺激，并加入TMZ或者Meto干预，用荧光探针Fluo-3AM检测胞内钙；Iso可使胞内钙增加，而不管是TMZ或和Meto均可逆转Iso诱发的胞内钙增加。此结果证实曲美他嗪能够抑制Iso诱发的胞内钙超载。
5.我们前期研究以普通C57BL/6小鼠皮下植入异丙肾上腺素（Iso，30mg/kg/d，14天）渗透性微泵，建立慢性心力衰竭模型，给予曲美他嗪、β受体阻断剂或二者联合干预，发现曲美他嗪能显著改善心力衰竭小鼠的舒缩功能，同时发现曲美他嗪可通过抑制内质网应激抵抗心肌细胞损害（该研究结果尚未发表，不便公开所有图片）。本项目是在我们前期研究的延续，是在前期研究的基础上，进一步探讨曲美他嗪治疗心力衰竭新的作用机制。
2．工作条件
（1）人员素质：本项目将在我们高血压研究所暨基因治疗中心完成。此中心先后承担了12个国家和5个部省级研究项目，培养了28名生化/分子生物学及临床学科的博士研究生和博士后人员，46名硕士研究生。现有专职研究人员3人，博士及硕士生30人。在这里接受了严格的分子生物和细胞生物学学研究训练，已经形成了一支非常优秀的研究队伍，而且大多数时候都能在实验室参加和直接指导实验工作。这些为完成本项目提供了最重要保证。
（2）本中心已经形成了国内一流的分子及细胞生物学实验室，与国外相应的实验室条件相当。包括620平方米面积的实验室（中央空调）、暗室、完备的分子及细胞生物学实验设备，2个细胞室、4个超净工作台和一个安全柜，4个CO2培养箱等，6台-80℃冰箱，7套Bio-Rad中小SDS-PAGE装置、2个120L液氮罐、杂交炉、电泳、凝胶成像及分析系统，测序-干胶系统、Beckman高速离心机、大型摇床和制水制冰机等等。能在实验室内完成而且常规进行基因克隆、Northern，Southern，Western Blots，基因测序实验，进行载体构件、病毒包装、转基因等实验；
（3）实验室装备了心血管专业研究的相关仪器，包括2台多导电生理仪（8导仪为美国 GE Marqutte KASE3000；4导仪为澳大利亚产品）、小动物动脉血压测量仪、膜片钳等；Millar心内导管检测系统（心脏血流动力测定）；
（4）装备本项研究所需的特殊设备：HPLC(Waters公司)加荧光检测系统(Waters)、紫外检测器、同位素检测器系统(Pakard公司)和液体闪烁计数器(Beckman LS6500)等，可用于CYP酶活性检测、荧光素酶表达的测定相关工作。
（5）装备有用于rAAV规模生产所需的BioReactor（美国NBS）和Purifier 10（Amersham/Pharmacia）。
（6）遗传学工作站：包括Real-Time PCR仪，新型基因测序仪、ABI7900基因分析仪和6台不同类型的PCR仪（包括高通量PCR仪）等设备。
（7）我们拥有无菌级动物房及实验室，可进行清洁级动物饲养和相关实验，本研究所需要的实验动物均已经到位。
总之，无论从人员素质、已经具有的实验室和实验室装备、我们的工作基础及经费等完全能保证本项目的完成。不需要添置大仪器设备。根据我们的条件，尤其是我们已经得到的初步研究结果看，预期能顺利完成并得到令人振奋的研究结果。
华中科技大学同济医学院附属同济医院 申请者：唐家荣