曲美他嗪对糖尿病合并心肌梗死患者心肌纤维化及运动耐量的影响
立论依据
　　糖尿病是冠心病重要的危险因素之一。对急性心肌梗死后无论是近期还是远期预后的随访发现，合并糖尿病患者的死亡率比非糖尿病患者明显升高。糖尿病是急性心肌梗死预后不良的一个独立危险因素，可导致死亡率加倍[1,2]，其机制可能涉及一个复杂的病理生理过程，包括高血糖，高胰岛素血症，内皮功能障碍，广泛的动脉粥样硬化，心肌能量代谢障碍，血液高凝状态，血小板功能障碍[3]。如何逆转糖尿病合并心肌梗死的病情进展，从而降低病死率已成为目前研究的热点。
　　心肌纤维化是指在心肌细胞外基质（ECM）中胶原纤维过量积聚，胶原含量显著升高或胶原成分发生改变，是机体对负荷、炎症或者心肌细胞坏死作出的一种适应性的反应，常见于高血压或者缺血性心脏病的病理生理状况。在这些病理情况下，心肌释放一系列生长因子如血管紧张素原、转化生长因子-β（TGF-β）、内皮素-1（ET-1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等最终导致细胞外基质的沉积[4]。糖尿病常见而严重的病理生理改变是过度的结缔组织沉积（病理纤维化），这是糖尿病性心肌病的主要特征，在其中增加的结缔组织导致心肌僵硬及随后的心功能不全，最终导致心力衰竭。糖尿病性心肌病病理改变涉及心肌肥厚和收缩功能受损，细胞外基质蛋白沉积增加，异常糖基化，从而导致舒张顺应性改变，最终的后果是心肌纤维化伴随心肌弹性下降和明显的心功能不全[5]。而心肌梗死后左心室重构是一个复杂的过程，涉及到梗死区和非梗死区，导致左心室扩大，心力衰竭甚至死亡。修复性纤维化发生在心肌梗死部位，是必不可少的，有助于重建坏死心肌保护心脏的完整性和避免心脏破裂，是瘢痕形成的过程。但是同时在非梗死心肌，也发生了反应性和修复性的间质纤维化。间质胶原基质在心肌梗死后非梗死区的愈合和重构中起着重要的作用。炎症可能在心肌梗死后心力衰竭的心肌纤维化过程中起重要作用。人们普遍认为，增加心脏胶原将增加舒张僵硬度，损害舒张弹性，导致左心室功能障碍[6]。心肌纤维化是受损组织僵硬度的结构基础，是心功能由代偿期向失代偿期转变的关键过程，抑制心脏纤维化有利于心功能的改善，因此，如何阻断这个环节显得十分重要。
　　MMPs亚型，尤其是MMP-2和MMP-9，消化胶原蛋白，使其他基质的胶原蛋白（如凝胶）、层粘连蛋白、弹性蛋白及纤维连接蛋白变性，这与纤维化疾病、肿瘤进展及炎症的病理学过程相关。在心血管系统，MMPs失调可导致组织损伤和炎症，活性增加导致心血管并发症。动物实验表明高血糖增加基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9在大鼠主动脉平滑肌细胞、血管组织及血浆中的活性及表达；MMP-2和MMP-9水平的增加导致血管重构。梗死心肌的MMP-2和MMP-9活性增加，导致收缩功能的下降和细胞外基质完整性的损害。抑制MMP-2和MMP-9有利于减少缺血/再灌注损伤从而减少糖尿病患者心肌缺血恶化[2]。
　　在延迟增强磁共振成像（DE-MRI）中的心肌延迟强化区（LE）和磷磁共振波谱（31P-MRS）中的心肌磷酸肌酸（PCr）/ATP比率降低在肥厚型心肌病中均有报道，分别表明心肌间质空隙增加伴随纤维化和心肌能量代谢的损害。LE的扩大和PCr/ATP比率之间的反比关系表明，在肥厚型心肌病患者31P-MRS检测的心肌能量代谢损害，可能与纤维化的存在相关，而不是一种原发性心肌改变[7]。因此，我们推测，在急性心肌梗死后心肌纤维化与能量代谢损害也存在相关性。
　 改善心肌代谢是治疗心血管疾病的一个新的途径，曲美他嗪作为一种优化心肌代谢的药物，对心肌缺血患者有良好的治疗作用[14]。高血糖状态下发生心肌梗死时心脏处于严重缺血缺氧及能量不足，心肌以脂肪酸氧化产生三磷酸腺苷（ATP）为主，葡萄糖氧化代谢受阻，必然增加氧的消耗。曲美他嗪作为长链3-酮酰辅酶A硫解酶抑制剂，能选择性地抑制线粒体酶-长链3-酮酰辅酶A硫解酶，使心肌代谢远离脂肪酸的β氧化并向糖的氧化代谢转化而优化心肌细胞的能量代谢[8]。有文献报道曲美他嗪可以抑制蛋白的糖化，降低空腹血糖，减少氧的消耗，从而在糖尿病心肌病中发挥治疗作用[9]。研究表明曲美他嗪可以改善胰岛素抵抗，这可能是通过调节内皮细胞功能和内皮素分泌有关，内皮素与多个胰岛素敏感性指标相关[10,11]。曲美他嗪对糖尿病合并冠心病患者左心室容积和左室射血分数的改善作用可能与曲美他嗪对心脏葡萄糖利用率的影响有关[12。13]。韩国急性心梗登记（KAMIR）研究 [15]是一项纳入13000名急性心肌梗死 患者的大型前瞻性观察研究，曲美他嗪缓释片被证实改善急性心梗患者的生存率，经过12个月随访，使用曲美他嗪显著降低再次经皮冠状动脉介入治疗的需要，减少主要心血管不良事件和全因死亡。
　　糖尿病合并急性心肌梗死后心肌间质纤维化更明显。曲美他嗪抗纤维化的机制可能与其能够显著降低急性心肌梗死患者血浆C反应蛋白水平，对白介素（IL）-1、IL-6和内皮细胞选择素反应水平的影响有关[18]；另外曲美他嗪能够使环磷酸鸟苷（cGMP）释放增加，内皮素-1释放减少，而脂质氧化与内皮素-1释放显著相关[19]。曲美他嗪可以改善糖尿病合并心肌梗死大鼠左心室舒张功能，可通过增加葡萄糖转运蛋白-4（GLUT4）表达，而改善胰岛素抵抗、提高胰岛素敏感性、改善糖代谢从而减轻糖尿病及心肌梗死引起的心室重构及心肌纤维化[20]。心肌纤维化导致心室代偿性肥厚向心力衰竭转化，可由结缔组织生长因子（CTGF）促进。一项动物实验显示曲美他嗪显著抑制主动脉缩窄大鼠胶原积累、CTGF表达及氧自由基生产。曲美他嗪减少血管紧张素II刺激产生的氧自由基（CTGF的合成信号转导通路的上游信号）增加，直接影响了心肌成纤维细胞增殖水平。此外，曲美他嗪通过转位调节亚基Rac1改善还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶活性。因此曲美他嗪有效抑制压力超负荷引起的大鼠心肌纤维化，可能是通过NADPH氧化酶-活性氧-结缔组织生长因子（NADPH oxidase–ROS–CTGF）信号转导通路[21，22]。但是曲美他嗪对于合并糖尿病心肌梗死患者预后是否改善以及与抑制心肌纤维化的关系未见临床报道。
　　运动耐量是目前有效观察心功能变化的指标。研究显示代偿性的缺血性心肌病予曲美他嗪处理6月后改善运动耐量并减少血浆脑钠肽和肌钙蛋白水平[23]。曲美他嗪减少X综合征患者运动过程中的心绞痛症状并改善运动耐量[24]。
　　本研究拟通过观察曲美他嗪对糖尿病合并急性心肌梗死患者能量代谢指标、纤维化指标、心血管事件发生率、心功能指标、运动耐量等的影响，探讨其改善糖尿病合并急性心肌梗死预后以及可能机制，为其在临床应用提供科学依据。
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研究内容及研究方案
(一) 研究目标和拟解决的关键问题
1. 明确曲美他嗪对糖尿病合并心肌梗死患者生化、纤维化、能量代谢指标的影响。
2. 明确曲美他嗪对糖尿病合并心肌梗死患者心功能的影响。
3. 明确曲美他嗪对糖尿病合并心肌梗死患者运动耐量的影响。
(二) 研究内容
1. 入选住院患者糖尿病合并确诊急性心肌梗死100例，随机分组为曲美他嗪组和对照组各50例。曲美他嗪组服用糖尿病合并急性心肌梗死常规药物和曲美他嗪（20mg/次，每天3次），对照组服用糖尿病合并急性心肌梗死的常规治疗药物和安慰剂（1片/次，每天3次），共计3月。
2. 研究方法:
    （1）各组患者均予入院第1天清晨、平卧、静息状态下抽取静脉血以检测糖化血红蛋白、脑钠肽（BNP）、总胆固醇、低密度脂蛋白（LDL）-胆固醇、高密度脂蛋白（HDL）-胆固醇、肝功能、血红蛋白、空腹血糖、D-二聚体、甲状腺功能、肾功能。入院后当时，12h，24h，48h分别检测心肌酶谱、肌钙蛋白（TnI）。
    （2）心脏超声：患者入院后予心超检查评估左室射血分数（LVEF）、左室舒张末期内径（LVEDD），根据左室流出道及二尖瓣血流频谱，测量左心室舒张功能指标：E波峰值速度(E)、A波峰值速度(A)、E峰与A峰速度比值(E／A)等。
    （3）冠脉造影：急诊或择期冠脉造影评价冠状动脉病变特点。并根据冠状动脉特点行血运重建（冠状动脉介入术或冠状动脉搭桥术）。
    （4）于急性心肌梗死发病后第7—8天时，经过一夜禁食后清晨抽血，2小时内分离血清并储存在20℃下备检测。①抽取5mL静脉血以ELISA方法检测H2松弛素、I型胶原、III型胶原浓度（最小检测浓度分别为8pg/L、10ng/ml、1ng/ml）。②能量代谢、炎性因子及氧化应激指标：MMP-2和MMP-9、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、转化生长因子（TGF-β）。
    （5）于急性心肌梗死发病后1月时，行运动耐量测试：各组患者均予六分钟步行试验，统计步行距离进行结果评估。并予行低水平运动平板试验，达标心率<120次/分。
（6）随访：出院后1、3个月门诊或电话随访，记录心血管事件发生情况。
    （7）安慰剂或曲美他嗪治疗后3月再次行抽血检查、心脏超声及运动耐量测试复查上述指标。
    3.根据上述统计学分析结果，总体评价曲美他嗪对糖尿病合并急性心肌梗死生化指标、纤维化指标、能量代谢指标、心功能指标及运动耐量的干预作用。
（一） 研究对象
筛选急性心肌梗死合并2型糖尿病患者，符合下列标准，入选共100例。
1. 入选标准
（1）所有患者均18岁以上，符合急性心肌梗死的诊断标准（必须至少具备以下3条标准中的2条）：①缺血性胸痛的临床病史； ②心电图的动态演变； ③心肌坏死的血清标志物浓度的动态改变。
（2）所有患者既往确诊2型糖尿病或入院时糖化血红蛋白（HbA1c）≥6.5％。既往确诊2型糖尿病符合2010年ADA（美国糖尿病协会）糖尿病诊断标准：1. 糖化血红蛋白（HbA1c）≥6.5％*。或2. 空腹血糖FPG≥7.0 mmol/l。空腹定义为至少8h内无热量摄入*。或3. 口服糖耐量试验时2h血糖≥11.1 mmol/l*。或4. 在伴有典型的高血糖或高血糖危象症状的患者，随机血糖≥11.1 mmol/l。* 在无明确高血糖时，应通过重复检测来证实标准1－3。
（3）患者志愿和知情同意书。
2. 排除标准
（1）甲亢、贫血、支气管哮喘、严重肝肾功能不全。
（2）感染、恶性肿瘤、免疫性疾病。
（3）明显出血倾向、出血性脑卒中。
（4）休克或低血压状态。
（5）孕妇、哺乳者。
（6）近三个月内正在参加其他临床试验者；
（7）拒绝参与。
（二） 研究方法
1. 筛选研究对象100例：
符合上述入选标准，随机对照研究。随机分组为曲美他嗪组和对照组2组，各50例。随机方法：准备1至50号序号信封，随机抽取，单号归为曲美他嗪组，双号归为对照组。
2. 治疗方法：
    对照组服用糖尿病和急性心肌梗死的常规治疗药物，包括口服降糖药、胰岛素针、抗血小板药、他汀类药物、ACEI/ARB、β受体阻滞剂、硝酸酯类等药物+安慰剂（1片/次，每天3 次）；共计3月。
曲美他嗪组服用常规药物+曲美他嗪（20mg/次，每天3次）；共计3月。
    3. 检查方法和观察指标：
安慰剂或曲美他嗪治疗前、治疗后3月分别行下列检查。
（1）分析两组患者性别、年龄、吸烟、高脂血症、高血压病等危险因素。
    （2）各组患者均予入院第1天清晨、平卧、静息状态下抽取静脉血以检测糖化血红蛋白、BNP、总胆固醇、LDL-胆固醇、HDL-胆固醇、肝功能、血红蛋白、空腹血糖、D-二聚体、甲状腺功能、肾功能。入院后当时，12h，24h，48h分别检测心肌酶谱、TnI。
    （3）心脏超声：患者入院后予心超检查评估左室射血分数（LVEF）、左室舒张末期内径（LVEDD），根据左室流出道及二尖瓣血流频谱，测量左心室舒张功能指标：E波峰值速度(E)、A波峰值速度(A)、E峰与A峰速度比值(E／A)等。
    （4）冠脉造影：急诊或择期冠脉造影评价冠状动脉病变特点，评估患者冠状动脉病变部位、狭窄程度。并根据冠状动脉特点行血运重建（冠状动脉介入术或冠状动脉搭桥术），评估血运重建后冠状动脉病变部位、狭窄程度。
（5）于急性心肌梗死发病后第7—8天时，经过一夜禁食后清晨抽血，2小时内分离血清并储存在20℃下备检测。①抽取5mL静脉血以ELISA方法检测H2松弛素、I型胶原、III型胶原浓度（最小检测浓度分别为8pg/L、10ng/ml、1ng/ml）。②能量代谢、炎性因子及氧化应激指标：基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、转化生长因子（TGF-β）。
    （6）运动耐量测试：所有患者住院期间行肺功能检查以排除肺功能损害对运动耐量造成的影响。所有患者急性心肌梗死发病1月后予六分钟步行试验，统计患者步行距离进行结果评估。按患者步行的距离划为4个等级：1级少于300米，2级为300～374.9米，3级为375～449.9米，4级超过450米。级别越低表示心肺功能越差。并予行低水平运动平板试验（达标心率<120次/分），以明确是否存在心肌缺血因素对运动耐量造成影响。
入选标准：经皮冠状动脉介入术（PCI）血管再通，TIMI血流Ⅲ级，无胸痛发作。排除标准：PCI未成功，低血压状态，反复胸痛，恶性心律失常（室速、室颤），合并重症感染、肺病、肝病或肾病，慢性透析患者，痴呆、脑卒中后遗症，四肢畸形或功能障碍，多器官功能衰竭，精神障碍，其他重症心肺疾患）。活动前：1. 无胸痛和呼吸困难等不适主诉，穿刺部位无出血、血肿；2. 心率50-90次/分，血压90-150/60-100mmHg，呼吸16-24次/分， 血氧饱和度95%以上。活动观察：1. 在条件允许的情况下，连接心电监测设备，并严密监测患者症状及穿刺部位情况；2. 如出现胸闷、胸痛，P≥120次，R≥30次/分，SpO2﹤95%，立即停止活动，连接心电监护设备行床旁心电图并通知医生。
（7）随访：出院后1、3个月门诊或电话随访，记录心血管事件发生情况。心血管事件定义：全因死亡，冠心病致死和发作（非致死性心肌梗死、血运重建、不稳定型心绞痛及充血性心力衰竭）。
（8）安慰剂或曲美他嗪治疗后3月再次行抽血检查糖化血红蛋白、BNP、总胆固醇、LDL-胆固醇、HDL-胆固醇、肝功能、血红蛋白、空腹血糖、D-二聚体、甲状腺功能、肾功能；H2松弛素、I型胶原、III型胶原浓度；基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、转化生长因子（TGF-β）。心脏超声及运动耐量测试复查上述指标。
    4.统计学分析处理：曲美他嗪组和对照组各观察指标统计分析，包括各项生化指标、纤维化相关指标、能量代谢指标、心超检查及六分钟步行试验/低水平运动平板试验等。
（三）技术路线
（四）统计方法
采用SPSS 18.0统计软件处理分析。所有计量资料均以（均数±标准差）表示，组间比较采用t检验；计数资料用百分数表示，组间比较采用卡方检验；P<0.05为差异有统计学意义。
研究基础
1.我们的研究团队已经初步证实对于异丙肾上腺素引起的心脏纤维化，给与松弛素可能通过抑制心脏的上皮—间充质转化（EMT）从而抑制心脏纤维化。在体外实验方面我们的研究小组同样证实松驰素通过阻断转化生长因子（TGF）-β诱导的内皮细胞向间质化细胞转化，从而抑制心肌细胞纤维化。
2.本研究团队成立来一直致力于内皮细胞生物学及分子机理研究，研究小组各成员均主持或参与过内皮祖细胞和内皮生长晕细胞研究，在国内一级及二级核心期刊上发表过许多相关文章，因此在研究内皮生长晕细胞方面具备丰富的经验和熟练、先进的技术。
3.本研究团队对血管重构的机制及干预进行了深入、系列的研究。在缺氧性肺血管重构中，对平滑肌细胞增殖和胶原表达异常及其机制进行研究，从气体信号分子、血管活性物质和信号通路等角度深入研究；应用多种药物如灯盏花素、科素亚等干预发现抑制、逆转血管重构，发表多篇论文，取得成果，同时也在临床上广泛应用。本研究团队在纤维化研究领域有着非常扎实的理论、实验和实践基础。
4.本研究团队具备经验丰富的科研人员和优良的硬件条件，可以为本研究的顺利完成提供必不可少的支持。
温州医科大学附属第一医院申请者：周浩