曲美他嗪对自发性高血压大鼠左室肥厚进展的作用与机制研究
立论依据
　　高血压是心血管疾病中患病人数最多的疾病之一，也是其它心血管疾病最普遍的始动因素之一。2012年，初步估计中国成年人患病总人数已突破3.5亿，高血压最大危害在于长期慢性的靶器官损伤，其中心室肥厚是最常见的靶器官损伤之一。心室肥厚是由于长期心脏负荷过重以及神经、体液因素的共同作用所导致的代偿性心肌细胞肥大及心室重构，随着病情的发展，最后发展为心力衰竭，临床上即使有效控制血压后，心室重塑损伤仍难以恢复1。因此，如何在早期控制血压的同时抑制细胞肥大、逆转左室重构，成为高血压治疗乃至心血管疾病预防的重点。
　　曲美他嗪是一种哌嗪类衍生物，既往大量研究报道均证实：曲美他嗪改善心衰患者内皮功能2、逆转心室重构及改善心功能3-5、保护心肌病患者心肌细胞6、改善冠心病心肌缺血/再灌注损伤7, 8、抑制支架植入术后血管再狭窄9等作用，其机制主要涉及：（1）选择性的抑制乙酰辅酶A酰基转移酶，从而抑制游离脂肪酸（FFA）的β氧化，增加葡萄糖的氧化，最终升高ATP含量，降低心肌细胞耗氧量，改善心肌细胞能量代谢10；（2）保护线粒体膜，抑制心肌细胞钙离子超载，并通过影响线粒体一氧化氮合酶以及活性氧簇的产生抑制线粒体mPTP开放，参与线粒体能量代谢的调节，减轻氧化应激对细胞的损伤11；（3）降低血管阻力，增加血流量，降低心肌耗氧量及心肌能量的消耗，从而改善心肌氧的供需平衡12。
　　近期有研究报道指出13，曲美他嗪在移植前处理脂肪变肝脏，可激活AMPK，下调内质网氧化应激以及增强自噬参与保护肝细胞的免疫损伤。AMPK(Adenosine 5-monophosphate (AMP)-activated protein kinase）,即AMP依赖的蛋白激酶，是生物能量代谢调节的关键分子，它表达于各种代谢相关的器官中，能被机体各种刺激激活，包括运动、激素及能影响细胞代谢的物质（如FFA、AMP/ATP）。AMPK活性被抑制时，能激活其下游信号分子mTOR/P70S6K，增加细胞蛋白质的合成，最终导致心肌细胞增殖与肥大14-17。
　　综上所述，我们推测：长期血压升高，心肌细胞细胞外压力负荷增加，心肌代谢增强，耗氧增加，能量代谢异常，曲美他嗪能抑制FFA氧化，增加葡萄糖氧化，升高细胞内FFA、ATP水平，刺激细胞内AMPK活性升高，从而抑制心肌细胞内下游蛋白质合成相关分子mTOR/P70S6K等，从而抑制细胞肥大发生，在早期发挥抗左室肥厚的作用。
References:
 1.Lai CC, Sun D, Cen R, Wang J, Li S, Fernandez-Alonso C, Chen W, Srinivasan SR, Berenson GS. Impact of long-term burden of excessive adiposity and elevated blood pressure from childhood on adulthood left ventricular remodeling patterns: the bogalusa heart study. J Am Coll Cardiol. 2014;64(15):1580-1587.
 2.Belardinelli R, Solenghi M, Volpe L, Purcaro A. Trimetazidine improves endothelial dysfunction in chronic heart failure: an antioxidant effect. Eur Heart J. 2007;28(9):1102-1108.
 3.Zhang L, Lu Y, Jiang H, Zhang L, Sun A, Zou Y, Ge J. Additional use of trimetazidine in patients with chronic heart failure: a meta-analysis. J Am Coll Cardiol. 2012;59(10):913-922.
 4.Fragasso G, Palloshi A, Puccetti P, Silipigni C, Rossodivita A, Pala M, Calori G, Alfieri O, Margonato A. A randomized clinical trial of trimetazidine, a partial free fatty acid oxidation inhibitor, in patients with heart failure. J Am Coll Cardiol. 2006;48(5):992-998.
 5.Fragasso G, Perseghin G, De Cobelli F, Esposito A, Palloshi A, Lattuada G, Scifo P, Calori G, Del MA, Margonato A. Effects of metabolic modulation by trimetazidine on left ventricular function and phosphocreatine/adenosine triphosphate ratio in patients with heart failure. Eur Heart J. 2006;27(8):942-948.
 6.Tuunanen H, Engblom E, Naum A, Nagren K, Scheinin M, Hesse B, Juhani AK, Nuutila P, Iozzo P, Ukkonen H, Opie LH, Knuuti J. Trimetazidine, a metabolic modulator, has cardiac and extracardiac benefits in idiopathic dilated cardiomyopathy. Circulation. 2008;118(12):1250-1258.
 7.Marazzi G, Wajngarten M, Vitale C, Patrizi R, Pelliccia F, Gebara O, Pierri H, Ramires JA, Volterrani M, Fini M, Rosano GM. Effect of free fatty acid inhibition on silent and symptomatic myocardial ischemia in diabetic patients with coronary artery disease. Int J Cardiol. 2007;120(1):79-84.
 8.Pantos C, Bescond-Jacquet A, Tzeis S, Paizis I, Mourouzis I, Moraitis P, Malliopoulou V, Politi ED, Karageorgiou H, Varonos D, Cokkinos DV. Trimetazidine protects isolated rat hearts against ischemia-reperfusion injury in an experimental timing-dependent manner. Basic Res Cardiol. 2005;100(2):154-160.
 9.Chen J, Zhou S, Jin J, Tian F, Han Y, Wang J, Liu J, Chen Y. Chronic treatment with trimetazidine after discharge reduces the incidence of restenosis in patients who received coronary stent implantation: a 1-year prospective follow-up study. Int J Cardiol. 2014;174(3):634-639.
10.Kantor PF, Lucien A, Kozak R, Lopaschuk GD. The antianginal drug trimetazidine shifts cardiac energy metabolism from fatty acid oxidation to glucose oxidation by inhibiting mitochondrial long-chain 3-ketoacyl coenzyme A thiolase. Circ Res. 2000;86(5):580-588.
11.Dedkova EN, Seidlmayer LK, Blatter LA. Mitochondria-mediated cardioprotection by trimetazidine in rabbit heart failure. J Mol Cell Cardiol. 2013;59:41-54.
12.Soukoulis V, Boden WE, Smith SJ, O'Gara PT. Nonantithrombotic medical options in acute coronary syndromes: old agents and new lines on the horizon. Circ Res. 2014;114(12):1944-1958.
13.Zaouali MA, Boncompagni E, Reiter RJ, Bejaoui M, Freitas I, Pantazi E, Folch-Puy E, Abdennebi HB, Garcia-Gil FA, Rosello-Catafau J. AMPK involvement in endoplasmic reticulum stress and autophagy modulation after fatty liver graft preservation: a role for melatonin and trimetazidine cocktail. J Pineal Res. 2013;55(1):65-78.
14.Hardie DG. AMPK: a key regulator of energy balance in the single cell and the whole organism. Int J Obes (Lond). 2008;32 Suppl 4:S7-S12.
15.Zhang BB, Zhou G, Li C. AMPK: an emerging drug target for diabetes and the metabolic syndrome. Cell Metab. 2009;9(5):407-416.
16.Srivastava RA, Pinkosky SL, Filippov S, Hanselman JC, Cramer CT, Newton RS. AMP-activated protein kinase: an emerging drug target to regulate imbalances in lipid and carbohydrate metabolism to treat cardio-metabolic diseases. J Lipid Res. 2012;53(12):2490-2514.
17.Scheuer J. Re: Trimetazidine, a metabolic modulator, has cardiac and extracardiac benefits in idiopathic dilated cardiomyopathy. Circulation. 2009;119(11):e371, e372.
研究内容及研究方案
研究目标、研究内容和拟解决的关键问题
1.1 研究对象
    SPF级雄性6w龄SHR大鼠（购于中南大学动物实验中心，由中南大学伦理会审批后进行实验）
1.2 研究目标
我们通过研究曲美他嗪对SHR大鼠左室肥厚进展的影响，并从AMPK影响蛋白质合成途径入手，探索曲美他嗪抑制左室肥厚进展的可能作用与机制，为曲美他嗪在心肌细胞保护作用研究提供新的实验依据，并进一步为其在高血压致左室肥厚早期干预治疗提供理论证据。
1.3 研究内容
1.3.1 SHR大鼠正常饲养，心肌肥厚发生时间；曲美他嗪不同浓度处理，量效曲线。
1.3.2曲美他嗪处理组与对照组间，血浆总FFA、未结合FFA含量及细胞ATP含量变化与心肌细胞肥大发生的关系。
1.3.3 曲美他嗪处理组与对照组间，心肌组织AMPK/mTOR/P70S6K各自mRNA、蛋白表达情况；以及P70S6K活性变化与心肌细胞肥大的关系。
1.4 拟解决的关键问题
1.4.1 曲美他嗪是否能够延缓或抑制心肌细胞肥大进展
1.4.2 曲美他嗪是否能通过调节FFA含量及ATP含量变化，影响AMPK/mTOR/P70S6K途径活化
1.4.3 AMPK/mTOR/P70S6K途径是否参与曲美他嗪延缓或抑制高血压致左室肥厚的进展过程
2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析、统计学方法
2.1 研究方法
2.1.1饲养SHR大鼠开始，每周用超声观察左室大小及室壁厚度，结合形态学，确定左室肥厚发生确切时间。
2.1.2曲美他嗪水溶液（0.25 nM、0.5 nM、1 nM、2 nM、4 nM）分别饲养SHR大鼠至对照组发生左室肥厚，确定曲美他嗪量效关系曲线。
2.1.3 心肌组织石蜡切片HE染色观察心肌细胞形态学变化；计算左室质量指数；应用数码采集图像分析仪，采用Takemori描述方法，测量心肌细胞横断面积。
2.1.4 Elisa试剂盒检测血浆总FFA、未结合FFA含量及ATP测定试剂盒检测细胞ATP含量变化。
2.1.5 RT-RCR与Weatern-bloting检测SHR心肌组织AMPK/mTOR/P70S6K，mRNA及蛋白表达，P70S6K活性试剂盒测定其活性。
2.2 技术路线
2.2.1 第一部分实验：曲美他嗪量效曲线研究（曲美他嗪溶于水，制成水溶液，口服）
2.2.2 第二部分：曲美他嗪对左室肥厚进展作用及机制
2.3 可行性分析
该项目立足于曲美他嗪影响心肌细胞能量代谢独特作用，借鉴曲美他嗪改善心衰动物或人的心功能，保护心肌细胞等相关研究，并参考国内外最新关于曲美他嗪在心肌细胞代谢中的研究，初步探索曲美他嗪对心肌细胞肥大发生的作用，并结合曲美他嗪对AMPK的激活作用，以及从影响细胞蛋白质合成的AMPK/mTOR/P70S6K途径入手探索曲美他嗪改善心肌细胞肥大的可能作用机制。立题新颖，提出假设合理可行，已通过本科室相关专家同行评审，认同该课题立题及实验方案。
本项目课题组成员均属于心血管专科研究人员，申请者已经从事多年从事心血管病的临床与基础科研工作，曾主持、参与湖南省科技厅、湖南省卫生厅等多项科研课题，均已结题，已公开发表相关论文数十篇，已顺利培养硕士研究生8名；本课题特聘请“湘雅名医”袁洪教授担任课题总指导，袁洪教授曾承担和参与国家863计划、科技支撑计划、攀登计划等课题30余项，发表论文100余篇，主编、参编《老年高血压》等著作10部，参与I～IV期新药研究40余项，获省部级成果5项，专利9项，开发相关产品和软件6项，完成研究生培养20名，袁洪教授团队能给本课题提供科学的技术指导及相关技术人员帮助。
本项目依托中南大学湘雅三医院临床药理中心、中南大学动物实验中心和湘雅三医院医学实验中心，实验设备与技术均能满足本课题的实施。
本研究已有较好相关的前期工作基础，在SHR相关高血压发病机制、左室肥厚进展方面已取得一定成果，本课题组参与者有很强的实验基础，在动物心脏超声检测、动物饲养、动物心脏手术与药物处理、生化指标检测等方面均有良好的工作基础。该实验中涉及的实验技术与实验试剂均能获得，确保实验顺利完成。
课题创新点
1.本实验结合当前曲美他嗪研究进展，率先提出其对心肌细胞肥大的作用
2.本实验结合曲美他嗪对AMPK的调节作用，推测其可能通过AMPK/mTOR/P70S6K途径影响蛋白合成，率先提出曲美他嗪对心肌细胞肥大影响的可能机制。
2.4 统计学方法
采用SPSS 21.0软件统计分析，实验数据计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较采用t检验，组间比较采用One-Way ANOVA分析，多组内两两比较采用S-N-K法，设定检验水准为0.05，P<0.05为有统计学意义；采用Graphpad Prism 6.01软件作图。
3.研究计划及预期研究成果
3.1 研究计划 （2年计划2015.03-2017.03）
2015.03-2015.06  项目实施，动物及试剂盒订购；文献检索查新。
2015.07-2015.11  实验实施，完成第一部分实验内容，确定实验条件
2015.12-2016.7   实验实施，完成实验，收集实验数据
2016.8-2016.10   数据整理，统计分析
2016.11-2017.3   文献查新，文章撰写及投稿
3.2预期成果
1.曲美他嗪能改善SHR左室心肌细胞肥大，延缓左室肥厚进展，其机制可能通过调节血浆FFA及细胞内ATP水平，激活AMPK/mTOR/P70S6K途径，从而影响细胞蛋白质合成；为曲美他嗪在高血压心肌肥厚患者中使用提供基础研究理论；
2.课题实施完成过程中，培养硕士研究生1-2名，发表1-2篇SCI论文，预期成果达国内领先水平。
研究基础
申请者近2年发表SC I及CSCD论文：
[1] Weihong Jiang（第一作者）, Lihua Tan, Yunzhong Guo, Xiaogang Li. Effect of renal denervation procedure on left ventricular hypertrophy of hypertensive rats and its mechanisms[J]. Acta Cirúrgica Brasileira - Vol. 27 (11) 2012 ，815-820.
[2] 谭丽华 蒋卫红（通讯作者），去肾交感神经对自发性高血压大鼠左室肥厚的影响及机制探讨[J]，浙江大学学报（医学版），2013,vol42.No5,550-555
[3] Sharma Manju, Xiaogang Li, Weihong Jiang（通讯作者）.Routes of administration of hormone replacement therapy and cardiovascular effects in postmenopausal.JGPEMN.2014.VOL.3,NO.1 Issue 4,50-61
[4] Xiaogang Li, Weihong Jiang（通讯作者）. Renalase, a new secretory enzyme: Its role in hypertensive-ischemic cardiovascular diseases [J]. Medical science monitor；2014; 20: 688-692
[5] Xiaogang Li, Weihong Jiang（通讯作者）. Renalase gene polymorphism in patients with hypertension and concomitant coronary heart disease [J]. Kidney and blood pressure research；2014;30;39(1):9-16
申请者具备的实验条件与技术优势：
1. 本项目依托中南大学湘雅三医院临床药理中心和湘雅三医院医学实验中心，该实验室中心拥有高级技术职称12名(其中包括四名全国知名兼职教授)，专业技术人员21名，10名具有博士学历;建筑面积近1800平方米，具有流式细胞仪、高效液相色谱仪、生物芯片扫描仪、荧光显微镜、医用高分辨率多功能显微系统、酶标仪、切片机、石腊包埋机、定量PCR仪、普通PCR仪、紫外分光光度计、超低温冰箱、高速冷冻离心机、凝胶成像分析系统、分子化学发光成像分析系统、原子吸收光谱仪、超声破碎仪、药物浓度检测仪、药物浓度分析仪，细胞培养间等设备设施;能开展分子生物学和细胞生物学、形态学和免疫学、实验动物学、临床药学等研究工作及特殊医学检验和服务工作，能为本实验完成提供技术及设备支持。
2.本研究已有较好的相关的前期工作，在高血压左室肥厚研究中已取得一定成果，数名心血管专科研究生已完成相关的实验基础，在细胞培养、病毒转染、动物饲养、动物心脏手术与药物干预、指标检测等方面均有良好的工作基础，项目申请者已熟练掌握心肌细胞培养、RT-PCR、 Westorn－blot和ELISA等实验方法；
中南大学湘雅三医院申请者：蒋卫红