硫辛酸改善大鼠急性心肌梗塞后心功能中的机制研究
立论依据
　　慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是各种心脏疾病发展的终末阶段，是心脏病患者死亡的首要原因。目前在发达国家中，成人心衰发病率已达1%～2%，70 岁及更大年龄的老人中心衰患者将超过其总人数的10%[1]。CHF现有诊疗方法主要包括改善心肌重塑、强心利尿、减轻心脏负荷和心脏辅助装置等综合性治疗。
近期针对改善CHF心肌细胞能量代谢的治疗途径也日益受到关注。Decherd[1]等在1934年指出CHF时心肌细胞处于“能量饥饿”状态。CHF时黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XO）蛋白表达和活性均上调，XO增加了心脏和血管的氧化应激[4]。基于此，我们通过结扎大鼠冠状动脉前降支建立CHF大鼠模型[5]，探讨硫辛酸处理后CHF大鼠的心功能变化，并探讨硫辛酸抗氧化作用机制在改善心功能中的作用，为进一步了解硫辛酸改善CHF大鼠心功能的相关机制奠定基础。
　　硫辛酸(Lipoic acid, LA)，属于维生素B类化合物，具有氧化型(LA)和还原型(DHLA)两种，其相对分子质量比水溶性抗坏血酸(aseorbate,  AsA, VitC)大，但比脂溶性生育酚(a. tocopherol, VitE)小，因此它既具水溶性又具脂溶性。相对于含硫、碳原子的单链结构化合物，如氧化型谷肤甘肤(GSSG)、氧化型抗坏血酸(DHA)、胱氨酸等不具备抗氧化性，LA具有由硫碳原子构成的封闭环状结构，其电子密度相对较高，且其抗氧化性能也相对较强。LA的抗氧化性质主要表现在其能清除体内多种氧自由基，并与其他的抗氧化剂相互协同作用，而且还能鳌合重金属离子等方面。LA在动脉粥样硬化中，可以通过抑制内皮细胞氧化应激、抑制内皮细胞凋亡、保护内皮细胞功能来发挥抗氧化保护作用。
　　近些年来动物实验证实LA可以剂量依赖性的降低过氧化产物斑块形成，也可以通过调节NF- x B的表达和抑制凋亡酶<Caspase-3、Caspase-9)的活性发挥其保护细胞抵抗凋亡的作用，并可以通过活化Akt抑制内皮细胞凋亡。最新研究证实，LA可以减少粘附因子、致炎细胞因子的表达和巨噬细胞的积聚，阻止粥样病变形成，保护内皮细胞。
 　　LA改善内皮功能。血管内皮细胞通过分泌多种血管活性物质调节血管紧张度、血液流变学以及细胞对血管壁的粘附。LA增加舒血管物质的生成。OX-LDL可抑制内皮细胞中一氧化氮合成酶(eNOS)活性并加速一氧化氮(nitric oxide , N0）的降解而使有生物活性的NO减少，导致内皮细胞功能失调。有实验证实，LA通过提高内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达，增加NO的生成起到改善血管功能的作用。LA抑制缩血管物质的作用。内皮素一1(ET-1)、血管紧张素（Ang-11)都是很强作用的缩血管多肽,OX-LDL可以促进血管内皮细胞和平滑肌细胞分泌释放ET---1和Ang- II，诱使血管收缩。动物实验证明，LA可以清除过量内皮素一1，达到降低血压，保护肾脏和血管目的。最新研究证实，LA通过阻止内皮素一1mRNA的过量表达，增加内皮内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表达，改善内皮细胞功能。另有实验证明，LA可以降低由血管紧张素II诱导的氧化应激引起的血压升高和激肽B1受体的表达增加。
　　LA抑制炎症反应。AS是一种典型的慢性炎症反应。OX-LDL刺激多种重要的炎性因子的表达，加速动脉粥样硬化的炎症反应。在病理条件下，如低氧、急慢性炎症、缺血损伤等，可引起内皮细胞的激活，继而表达一些粘附分子。一些炎症因子TNFa和IL一1通过增加粘附分子的表达而促进白细胞对内皮的粘附，加重内皮细胞的损伤。LA可以使细胞粘附分子ICAM-1和VCAM -1的表达下调，减少内皮细胞因子生成，抑制炎症反应，缓解内皮功能紊乱。最新研究证实，LA可以减少粘附因子，致炎细胞因子的表达和巨噬细胞的积聚，阻止粥样病变形成，保护内皮细胞。
　　LA抑制硝酸甘油（GTN）耐药。在硝酸甘油耐药中，生物降解转化的NO减少、活性降低，影响内皮依赖性血管舒张功能。耐药和内皮功能紊乱依赖不同来源的ROS,但存在联系。最近研究阐明了的新机制，GTN诱导的活性ROS抑制ALDH2的生物活化。在动物实验和人体研究中发现，主动脉或心脏线粒体内ALDH2活性与氧化应激水平显著相关。长期应用GTN能明显促进线粒体内氧化应激，并且减弱ALDH2活性，进而阻断GTN的生物转化。由此可见，LA可抑制机体氧化应激反应及炎症反应，保护内皮细胞，抑制AS，在ACS发生发展中起重要的保护作用。
根据以上的各领域研究现状，我们可以看出ALDH2活性、hs-CRP及8-isoPGF2a含量与ACS存在一定的相关关系，LA对保护ACS大鼠心肌具有一定作用，但是LA是怎样对ACS大鼠发挥保护心肌作用的?ALDH2是体内重要的抗氧化应激保护因子，其活性升高可以保护心肌，在ACS患者中是如何保护的?可能存在哪些机制?本课题针对以上问题所设计。
参考文献：
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[2] Hirsch GA, Bottomley PA, Gerstenblith G,et al.Allopurinol acutely increases adenosine triphospate energy delivery in failing human hearts[J].J Am Coll Cardiol. 2012 Feb 28;59(9):802-8.
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[4] Engberding N, Spiekermann S, Schaefer A,et al.Allopurinol attenuates left ventricular remodeling and dysfunction after experimental myocardial infarction: a new action for an old drug?[J].Circulation. 2004 Oct 12;110(15):2175-9.
[5] Carmen Methner, Guido Buonincontri, Chou-Hui Hu,et al.Riociguat Reduces Infarct Size and Post-Infarct Heart Failure in Mouse Hearts: Insights from MRI/PET Imaging[J].PLoS One. 2013 Dec 31;8(12):e83910.
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[7] 符路娣,蔡海云.介绍一种简便的大鼠灌胃方法[J].中兽医学杂志,2006,(3):36-37.
研究内容及研究方案
3.1  研究内容
　　本项目针对“慢性心力衰竭心肌能量代谢重塑的抗氧化机制”问题，提出“硫辛酸可以改善CHF大鼠的心功能，其机制可能与其抗氧化作用有关”的设想。硫辛酸可能一方面通过减轻脂质过氧化，减少CHF大鼠MDA生成；另一方面硫辛酸改善ROS对心肌线粒体呼吸链酶活性损伤，增加线粒体呼吸链酶Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ活性；硫辛酸还可能通过抑制iNOS表达，减少强氧化剂（ONOO－）生成，来改善CHF大鼠的心功能。
3.2 研究方法
　　6 周龄的雄性SD大鼠35 只，体质量（200±20）g，将35 只大鼠随机分为硫辛酸处理组（（AMI+硫辛酸，n =12）、对照组（AMI+NS，n =13）和假手术组（sham-operated +NS，n =10），硫辛酸处理组和对照组大鼠结扎冠状动脉前降支建立急性心肌梗死（acute myocardium infarction，AMI）模型，假手术组大鼠只穿线不结扎。术后第2天，硫辛酸处理组给予硫辛酸(50mg/kg?d)灌胃，对照组和假手术组大鼠给予生理盐水（normal saline，NS）灌胃。8周后，检测并比较分析各组大鼠的心功能、血清脑钠尿肽（Brain Natriuretic Peptide，BNP）含量、黄嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XO）蛋白表达、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、线粒体呼吸链酶Ⅰ-Ⅳ的活性、心肌组织形态以及心肌诱导型一氧化氮合酶（induce-nitri-coxide synthase，iNOS）的表达量。
3.3 研究计划及预期研究成果
3.3.1 研究计划：2014.10-12月实验准备；2015.1-6月 动物实验及实验研究；2015.7-9月 数据整理、统计、论文撰写发表。
3.3.2预期成果：发表高质量论文1-2篇；培养硕士生1-2名。
研究基础
　　项目申请人刘地川2007年申请的国家自然科学基金（介入声－化学消融心肌的实验研究）已结题，申请的重庆市科学技术委员会（抑制丙二酰辅酶A脱酶改善心肌能量代谢）已完成，发表SCI、CSCD文章多篇，在能量代谢研究中积累了较好的基础。
　　其所在的学科为国家临床重点专科，项目依托超声医学国家工程研究中心与重庆市超声医学工程省部共建国家重点实验室。在超声微泡介导基因领域处于国内领先地位。已具备完成此项实验任务所需的场地、仪器设备和相关条件，参加人员各方面素质齐全，实验室人员具有较成熟的动物实验和细胞生物学实验技术操作能力。项目成员熟悉动物模型构建、细胞培养、细胞和组织免疫荧光、PCR和Western blot等技术，有成熟、稳定的技术保障。学校基础医学研究所、动物实验中心、本院心功能室可为本项目动物模型制备、基础机制研究和心脏功能测定提供硬件支持。
（1）所需SPF级雄性SD大鼠，可于重庆医科大学实验动物中心购得。
（2）所需仪器如：超净工作台，荧光显微镜（Olympus Opitical公司），倒置相差显微镜TS100（Nikon公司），LEICA Q-500IW图像分析处理系统、Image-Pro Plus 4.0 专业图像处理软件、超速离心机等均具备。
（3）各种试剂、相关试剂盒及各种缓冲液等国内外均有销售。

重庆医科大学附属第二医院申请者：刘地川