曲美他嗪调节内皮祖细胞抗氧化应激机制研究
立论依据
　　活性氧（reactive oxygen species，ROS）是细胞内多种氧化还原反应的代谢产物。在正常情况下，机体内ROS的产生和清除处于动态平衡状态。当机体在受到内源性或外源性有害因素刺激时，导致ROS生成增多，打破原有的平衡，即出现氧化应激（oxidative stress）。氧化应激可引起DNA氧化损伤和蛋白质表达异常，使机体处于易损状态，从而导致多种疾病（包括缺血性心脏病）的发生发展，
1.1 研究证实氧化应激对内皮祖细胞数目与及功能均有严重影响。
　　1997年Asahara等首先由外周血中分离出了骨髓来源的CD34+和KDR+的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，它是内皮细胞的前体细胞。已知生理情况下，EPCs主要储存在骨髓中，在组织缺血、损伤、某些细胞因子和药物等的刺激下EPCs可以迁移动员至外周血，参与靶器官的修复。
　　近几年，有关EPCs参与心血管疾病的发展和演化的研究越来越引起人们重视。人们已经认识到EPCs有整合到血管壁上参与内皮修复的能力。增加实验动物中的活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量，将会导致内皮功能紊乱；而内皮损伤刺激ROS的产生，又会导致内皮细胞激活和炎症介质释放。这样形成一个恶性循环，最终使得氧化应激有害产物的生成增加，严重损害EPCs的功能。研究证明，C反应蛋白（c-reactive protein， CRP），氧化低密度脂蛋白（Oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）等均能诱导EPCs的凋亡[1,2]。EPCs数量的减少可直接导致内皮功能的紊乱和血管修复能力的减低。我们前期的实验证明氧化应激能够诱导EPCs的凋亡，减少EPCs的动员和归巢 [3]。

1.2  曲美他嗪作为一种新型抗心肌缺血药物对EPCs的氧化应激起到保护作用，但是其具体机制不详。
　　曲美他嗪[Trimetazidine,TMZ,化学名为1-(2,3,4-三甲氧苄基)呱嗪盐酸盐]是一种优化心肌能量代谢的抗心肌缺血药物。近年来,随着介入治疗和冠状动脉搭桥术的开展,冠心病患者的预后得到进一步改善,但是药物治疗仍然是基础。在药物治疗中,除了常规的冠心病二级预防外,优化心肌能量代谢途径成为新的干预手段。
　　正常心肌的能量来源主要是葡萄糖和脂肪酸氧化代谢。前者分为无氧酵解和有氧氧化。脂肪酸氧化代谢产生等量三磷酸腺苷（ATP）的耗氧量比糖代谢高,因此其产生ATP的效率要比糖代谢低。当脂肪酸代谢增强时,葡萄糖氧化代谢受阻,不但会使耗氧增多,还使糖酵解的产物(如乳酸)积累。而清除这些代谢废物不但消耗大量ATP,还使细胞内pH值下降,酸化加重,影响Ca2+平衡。心肌缺血改变从根本上说是一个代谢紊乱问题,即二磷酸腺苷(ADP)氧化磷酸化速率与ATP分解速率失衡,能量供应难以满足心肌组织的代谢需要。当心肌缺血时,冠脉血循环中的脂肪酸升高,心肌的能量代谢以脂肪酸代谢为主,不但使心肌收缩力下降,心肌细胞功能和结构受损。因此，减少脂肪酸的氧化,提高葡萄糖、丙酮的氧化磷酸化是一条有效的治疗途径。TMZ的药理作用机制主要在于影响细胞尤其是心肌细胞的代谢。TMZ通过激活丙酮酸脱氢酶或者抑制内毒碱棕榈酰基转运酶-1,达到抑制脂肪酸的氧化磷酸化,使心肌细胞的氧化底物从脂肪酸转变为葡萄糖,促进葡萄糖的利用,提高心肌细胞产生能量的效率并由此减少脂肪酸氧化后带来的副作用[4]。有学者报道[5],经99mTc成像方法研究证明TMZ能维持缺血心肌的细胞代谢。由此可见,TMZ改善心肌代谢状况,使其在缺氧情况下,耗氧减少,产生能量的效率提高。
　　本课题组前期实验发现，在曲美他嗪预处理下，EPCs抗氧化能力明显增强，氧化应激造成的增殖、粘附、迁移功能障碍得到明显改善[3]。

1.3  硫氧还蛋白系统是体内重要的抗氧化系统，可能是TMZ减轻EPCs氧化应激的机制之一。
　　硫氧还蛋白系统由硫氧还蛋白（thioredoxins, TRXs），NADPH，和硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase， TRXR）和硫氧还蛋白相关蛋白（thioredoxins-interecting protein，TXNIP）组成[6]。
　　TRX是在哺乳动物研究最深入的硫氧还蛋白家族成员，在细胞内外均可起作用。研究发现，硫氧还蛋白从还原态被氧化为氧化态时把电子传给靶蛋白，氧化态的TRX由NADPH提供电子，被TRXR还原,发挥其氧化还原调节功能[7]。TRX也可以通过直接清除自由基发挥抗氧化作用，如直接清除过氧化氢或清除单线态氧以及直接与活性氧ROS反应来减轻细胞的氧化应激；除了转换二硫键外，TRX还可通过增加血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1）来抵抗氧化应激[8]。此外，Park等发现，
在低氧损伤下，人EPCs内的TRX明显升高[9]。
　　硫氧还蛋白相关蛋白（TRX-interacting protein ，TXNIP),最初在用1α ,25-二羟基维生素 D3处理HL-60细胞时作为一个上调基因被报道[10]。TXNIP能够直接与TRX的氧化还原活性中心结合，并被认为是TRX的一个内源性还原活性的负性调节者。在一般情况下，体内TRX与TXNIP保持着一种相对平衡。Zhou等研究发现调节TRX/TXNIP的平衡可以促进氧化应激对NLRP3炎性小体的激活，TXNIP绑定则可激活巨噬细胞中NLRP3炎性小体与IL-1β[11]，加重血管损伤。而ROS的产生则可诱导TXNIP与NLRP3炎性小体的绑定，加重氧化应激 [12]。我们的实验也证实上调TRX的表达，下调TXNIP的表达可以减轻氧化应激对血管内皮细胞的损伤[13]。
综上所述，我们猜测：曲美他嗪通过调节TRX/TXNIP的平衡以起到抗EPCs氧化应激的功能，从而减轻氧化应激所造成的EPCs增殖、迁移、粘附、分泌各种细胞因子等生物学功能的降低，最终起到抗EPCs氧化应激的心肌保护作用。
　　本课题拟用H2O2诱导EPCs氧化应激的细胞模型，研究EPCs受到氧化应激损伤时，曲美他嗪对细胞内TRX以及TXNIP的影响，探讨曲美他嗪、EPCs、硫氧还蛋白系统作为抗氧化应激靶点的可能性，以期为缺血性心脏病的预防和治疗提供新思路。
参考文献：
1.    Fujii H, Li SH, Szmitko PE, Fedak PW, Verma S: C-reactive protein alters antioxidant defenses and promotes apoptosis in endothelial progenitor cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2006, 26(11):2476-2482.
2.    Tie G, Yan J, Yang Y, Park BD, Messina JA, Raffai RL, Nowicki PT, Messina LM: Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis in endothelial progenitor cells by inactivating the phosphoinositide 3-kinase/Akt pathway. J Vasc Res 2010, 47(6):519-530.
3.    Wu Q, Qi B*, Liu Y, Cheng B, Liu L, Li Y, Wang Q: Mechanisms underlying protective effects of trimetazidine on endothelial progenitor cells biological functions against H2O2-induced injury: involvement of antioxidation and Akt/eNOS signaling pathways. Eur J Pharmacol 2013, 707(1-3):87-94.
4.  Stanley WC,Lopaschuk GD,Hall JL.Regulation of myocardial carbohydrate metabolism under normal and ischaemic conditions.Potential for pharmacological interventions[J].Cardiovasc Res,1997,33(2):243-257.
5.  Ciavolella M,Greco C,Tavolaro R,et al.Acute oral trimetazidine administration increases resting technetium 99m sestamibi uptake in hibernating myocardium[J].J Nucl Cardiol,1998,5(2):128-133.
6.  Nodberg J,Arner ES.Reactive oxygen species, antioxidants,and the manmmalian thioredoxin system. Free Radicol Med,2001;31:1287-1312
7.  World Cameron, B.B., Thioredoxin in the Cardiovascular System—Towards a Thioredoxin-Based Antioxidative Therapy. Studies on Cardiovascular Disorders 2010: p. 499-516.
8.   Dler Faieeq Darweesh Mahmood, A.A., Khadija El Hadri, Thomas Simmet, Mustapha Rouis, The Thioredoxin System as a Therapeutic Target in Human Health and Disease. Antioxidants & Redox Signaling, 2013.
9.   Keon-Jae Park,Yeon-Jeong Kim, Expression Pattern of the Thioredoxin System in Human Endothelial Progenitor Cells and Endothelial Cells Under Hypoxic Injury. Korean Circ J. 2010 Dec;40(12):651-8.
 10.    Nishiyama A, Matsui M, Iwata S, Hirota K, Masutani H, Nakamura H, Takagi Y, Sono H, Gon Y, Yodoi J: Identification of thioredoxin-binding protein-2/vitamin D(3) up-regulated protein 1 as a negative regulator of thioredoxin function and expression. J Biol Chem 1999, 274(31):21645-21650.
11.    Zhou R, Tardivel A, Thorens B, Choi I, Tschopp J: Thioredoxin-interacting protein links oxidative stress to inflammasome activation. Nat Immunol 2010, 11(2):136-140.
12.    Xiang M, Shi X, Li Y, Xu J, Yin L, Xiao G, Scott MJ, Billiar TR, Wilson MA, Fan J: Hemorrhagic shock activation of NLRP3 inflammasome in lung endothelial cells. J Immunol 2011, 187(9):4809-4817.
13.  Liuhua Liu,Yun Liu,Benling Qi*,Qinqin Wu,Yuanyuan Li and Zhaohui Wang. Nicorandil attenuates endothelial VCAM 1 expression via thioredoxin production in diabetic rats induced by streptozotocin.Molecular Medicine Reports.Accepted. 
研究内容及研究方案
1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题
1.1 研究目标
（1）明确曲美他嗪在抗EPCs氧化应激中的作用。
（2）研究TRX以及TXNIP在曲美他嗪抗EPCs中的作用，探讨曲美他嗪、EPCs、硫氧还蛋白系统作为抗氧化应激靶点的可能性，以期为缺血性心脏病的预防和治疗提供新思路。
1.2研究内容
本项目拟着重研究在H2O2诱导的EPCs氧化应激模型中，曲美他嗪对其的保护机制，以进一步揭示抗氧化应激的靶点，主要内容如下：
以人脐血来源的EPCs细胞，预先给予或不给于曲美他嗪干预，建立氧化应激模型，检测EPCs增殖、迁移、分泌功能，以及EPCs中TRX、 TXNIP的表达。
1.3拟解决的关键问题
（1）明确曲美他嗪在抗EPCs氧化应激中的作用，并揭示其机制是本课题拟解决的科学问题。
（2）采用免疫学和分子生物学技术通过离体实验研究，从分子、细胞水平 证实曲美他嗪以及TRX/TXNIP系统在EPCs氧化应激中的作用。重点探讨曲美他嗪与TRX/TXNIP在EPCs氧化应激中的关系，有望阐明曲美他嗪抗EPCs氧化应激的机制，探讨曲美他嗪、硫氧还蛋白系统作为抗氧化应激靶点的可能性，从而为缺血性心脏病的预防和治疗提供新思路。
2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析、统计学方法
2.1拟采取的研究方法、技术路线、实验方案
取人脐血来源EPCs，用免疫磁珠分选法收集EPCs，用流式细胞仪鉴定EPCs，将细胞移入铺有明胶的培养瓶中，加入含胎牛血清的内皮祖细胞培养液培养。具体分组如下：
（1）空白组：未作任何处理的EPCs
（2）氧化应激组：H2O2处理+未加TMZ的EPCs
（3）曲美他嗪组：H2O2处理+加入TMZ的EPCs
收集上述各组EPCs，检测其增殖能力，迁移能力，炎性因子分泌（caspase-1、IL-1β、IL-18）以及TRX、TXNIP蛋白及mRNA表达。技术线路图如下：
2.2可行性分析、统计学方法
2.2.1可行性分析
（1）研究目标切实：本课题的实验设计依托于前人的设计和经验，国外研究已证实TRX与氧化应激之间的必然联系，有充足的理论依据，且研究内容的深度和范围较恰当。
（2）研究基础扎实：本项目是我们课题组在既往研究的基础上的继续与深入，无论是氧化应激模型的建立、内皮祖细胞分离培养技术、还是本课题所需的各实验技术均已成熟；申请者所在学科为省级重点学科，且同课题组的主要成员一道在氧化应激模型制备、内皮祖细胞培养及其他细胞生物学和分子生物学技术等方面积累了一定的经验，形成了相对稳定的研究团队。
（3）本院设有心血管疾病研究所，为国家重点学科，技术力量雄厚，在临床资料搜集、在细胞的培养及其他细胞生物学和分子生物学技术等方面积累了丰富的经验。且所需实验材料与试剂均有市售。
2.2.2统计学方法
本研究拟采用SPSS 20.0分析结果。
3.研究计划及预期研究成果
3.1研究计划
2015.1-2015.12 培养细胞，明确曲美他嗪与TRX及TXNIP的关系和抗氧化机制。
2016.1-2016.12 实验结果分析和总结，撰写论文，扩展本课题组的研究内容并呈交结题报告。
3.2预期研究成果
（1）阐明曲美他嗪抗EPCs氧化应激的作用；
（2）阐明曲美他嗪与TRX、TXNIP在EPCs氧化应激中的关系及分子机制；
（3）成果以论文形式推广，预计可发表SCI收录文章1-2篇，培养博士研究生1名，硕士研究生2名。
戚本玲