曲美他嗪治疗慢性心力衰竭的代谢组学研究
立论依据
　　慢性心力衰竭（Chronic Heart Failure， CHF）是各种病因导致心血管疾病的严重阶段。随着社会老龄化和医疗救治技术提高，心力衰竭患病率正逐年增加。据统计，目前我国人群中心衰的患病率0.9%，心力衰竭正在成为我国重要的公共卫生问题之一。慢性心力衰竭是一种进展性疾病，即使没有新的心肌损害，仍可通过心室重构不断进展。20世纪90年代以来，慢性心力衰竭的治疗发生了根本性变化，从关注短期血流动力学改善转变为长期的修复性策略，以改变衰竭心脏的生物学性质；从采用强心、利尿、扩血管药物治疗转变为神经内分泌抑制剂。心衰的治疗目标不仅仅是改善症状、提高生活质量，更重要的是针对心肌重构的机制，防止和延缓心肌重构的发展，从而降低心衰的病死率和住院率[1]，但预后仍然不尽人意，5年死亡率仍与恶性肿瘤相仿。因此，探索心力衰竭的的发生机制，寻找新的合适的治疗靶点，在现有基础上进一步提高患者的生存质量、减少患者病死率，成为心衰的主要研究方向。心衰的能量代谢机制正是目前的研究热点之一。
　　心脏是人体内消耗能量最多的器官。每天心脏消耗的ATP可达6kg，约为自身重量的20-30倍。心脏的能源需求几乎包括所有的营养物质如脂肪酸、葡萄糖、乳酸甚至酮体均可被心脏摄取利用。生理情况下脂肪酸与葡萄糖是心脏的主要能量的来源，而在饥饿或者运动状态下，酮体与乳酸成为重要能量补充。完整的心脏能量代谢可概括为三方面：① 营养物质的摄取及利用，主要包括脂肪酸及葡萄糖等物质的摄取及代谢；② 氧化磷酸化，通过线粒体呼吸链产生ATP；③心肌纤维ATP的转运及利用。慢性心力衰竭时上述三方面均可受到损害。慢性心力衰竭时脂肪酸代谢、葡萄糖代谢均显著降低，同时ATP合成及转运明显减少，其分解产物ADP则明显增加。长期系列研究表明衰竭心脏在能量代谢方面主要表现为两大改变：一是高能磷酸化合物含量的减少，首先表现为能量储备复合物磷酸肌酸（PCr）的减少；二是在肥厚和衰竭心脏中能量的利用模式由成人型主要利用脂肪酸转向胚胎型主要利用葡萄糖转变。在相同的氧耗条件下，一分子葡萄糖氧化比一分子脂肪酸氧化消耗的氧气更少[2] ，心脏产生能量更高效。此外，由于脂肪酸氧化的抑制刺激了葡萄糖氧化的增加，导致糖酵解和葡萄糖氧化之间的比例失衡的改善，从而减少质子的产生和改善心肌酸中毒，提高心脏效能[3]。提示对心衰心脏进行代谢干预，可改善心脏功能。大量临床证据显示，β受体阻断药、血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI）、血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂（ARB）均可以改善心衰患者的预后。一些针对心脏底物代谢途径的药物已经初步显示出临床疗效。
　　目前常用的优化心脏能量代谢的临床药物曲美他嗪，是一种3-酮脂酰CoA硫解酶抑制剂，既不增加氧耗量也不增加氧供给，主要通过抑制线粒体内长链3-酮脂酰CoA硫解酶（3-KAT），使能量代谢从耗氧较多的脂肪酸氧化转移到葡萄糖氧化，利用有限的氧产生更多三磷酸腺苷并增加磷脂的合成，从而提高心肌收缩功能。同时该药物还可以使脂肪酸代谢产生的乙酰辅酶A减少，从而刺激丙酮酸脱氢酶，间接促进葡萄糖氧化。曲美他嗪能够迅速恢复细胞膜磷脂合成、减轻细胞内酸中毒和钙超载、优化线粒体能量代谢，发挥心肌保护作用。众多研究显示，曲美他嗪不仅可以缓解心绞痛症状，并改善预后，同时能显著改善患者生活质量、社会功能以及心理健康，帮助其实现全面心脏康复[4-9]。
代谢组学方法由Nicholson于1999年首次提出，意指对生物系统因病理生理或基因改变等刺激所致动态参数代谢应答的定量测定。和基因组、蛋白质组这些传统的组学相比，代谢组学更接近生命活动的终端，反应其正在发生的变化。代谢组学通过检测代谢物水平的整体和动态变化规律，建立适当的分类模型，提取相关的生物代谢标志物簇，作为疾病诊断、个体化治疗的依据，同时确定该变化规律与生物过程的有机联系，从而揭示疾病发生、发展的机理[10]。代谢组学具有以下优点：(1)研究对象主要是生物体液，包括血清、尿液、脑脊液、胸水等。这些标本的采集和处理更加简单快捷；(2)代谢物是各种基因蛋白质功能执行的产物，基因蛋白质的改变在代谢水平会得到放大从而使检测更为容易；(3)代谢物的种类要远小于基因和蛋白的数目，每个生物体中代谢产物大约在103数量级，而最小的细菌，其基因组中也有几千个基因。代谢组学的研究不需建立全基因组测序及大量表达序列标签(EST)的数据库；(4)代谢组学研究结果更容易与临床生化功能活动相联系；(5)各种生物组织中代谢物结构一致，没有种属特异性，所以研究中采用的技术更为通用。代谢组学研究两个最主要的技术平台分别是磁共振技术(NMR)和质谱(GS)技术，两种技术各具优势也各有局限。例如Brindle等[11]于2002年报道用代谢组学模式识别方法快速、无创诊断冠心病并进行严重程度分级，首次将代谢组学方法用于冠心病诊断。 结果显示应用1H-NMR技术，能很好区分冠心病和冠状动脉正常人及不同冠脉狭窄程度患者的血清，诊断敏感度和特异度达92％和93％。尽管代谢组学应用于心血管疾病起步较晚，但在该领域的基础与临床研究均已开始[12-15]。Kang等[16]通过基于磁共振的代谢组学方法分析了缺血性心力衰竭患者的尿液代谢物，试图了解心力衰竭的代谢途径，找到其特征性标志物，该研究将15例原发性缺血性心力衰竭患者作为试验组，20例健康者作为对照组，分析数据后结果显示，心力衰竭组醋酸盐和丙酮水平较健康组高，并且还伴有甲基丙二酸的代谢紊乱。心力衰竭患者与健康组相比，尿液中还有胞嘧啶和苯乙酰甘氨酸的升高与1-甲基烟酰胺的降低。心力衰竭患者柠檬酸循环代谢物和脂肪酸代谢的改变提示与能量代谢有关。充血性心力衰竭可导致心肌重构，增加心房纤颤的敏感性，但目前对其潜在的机制却了解甚少。DeSouza等[17]应用高通量的蛋白质组学和代谢组学分析了假手术组的充血性心力衰竭狗的左心室心肌细胞和组织，蛋白质提取物使用双向凝胶电泳分析，心脏的代谢物由高分辨率的NMR分析，发现蛋白质结构广泛发生变化，结蛋白和细丝蛋白的碎片提示结构损害，而且电子显微镜也证实了这一点。心脏保护的热休克蛋白也发生了广泛的改变，一些蛋白 (HSP27、HSP60、HSP70)快速增加，而另一些蛋白(GRP78、α-β-crystalline、HSP90)延迟增加，苹果酸脱氢酶(DH)、α-/β-烯醇酶和丙酮酸脱氢酶的早期上调和大量酶的推迟下调以及伴随的代谢变化提示针对代谢应激有一个不断变化的适应性反应，早期代谢表达的变化表明充血性心力衰竭的发展诱导葡萄糖和丙氨酸浓度的增加，并得出结论，充血性心力衰竭导致心房蛋白组和代谢组发生事件依赖性变化。由此可见，代谢组学的发展，为无创检测心肌代谢提供更为全面和可靠的途径。
　　本研究拟采用GC-MS技术检测慢性心力衰竭患者的血清代谢谱，观察曲美他嗪对慢性心力衰竭心肌代谢的影响，为慢性心力衰竭的代谢治疗提供有力依据。
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研究内容及研究方案
1.研究目标
1.1阐明曲美他嗪提高运动耐量，改善心功能的作用。
1.2阐明曲美他嗪提高运动耐量是通过改善心肌能量代谢实现的。
1.3阐明血清代谢组学方法在评价心肌能量代谢的应用价值。
2.研究内容
2.1通过对比慢性心力衰竭患者服用曲美他嗪前后， BNP、心脏彩超计算LVEF评价曲美他嗪改善心功能的作用。
2.2通过对比慢性心力衰竭患者服用曲美他嗪前后，心脏彩超计算MEE，双核素心肌显像（DISA）评价曲美他嗪改善心肌代谢的作用。
2.3.通过对比血清代谢组学方法与心脏彩超MEE以及DISA的相关性，评价代谢组学在评价曲美他嗪改善心肌代谢中的应用价值
3.拟解决的关键问题
3.1质谱分析血清标本的制备
3.2血清代谢物的筛选
3.3代谢组学分析数据的整理及解释
4.研究方法
4.1病例入组标准：年龄>18岁，经冠脉造影或冠脉CTA明确诊断冠心病，按照《中国慢性心力衰竭诊断治疗指南》的诊断标准，症状及体征符合：夜间阵发性呼吸困难、颈静脉怒张、肺部哕音、心脏扩大、急性肺水肿、第Ⅲ心音奔马律、肝颈静脉返流阳性。次要标准有：踝部浮肿、夜间咳嗽、劳力性呼吸困难、胸水。收缩性心力衰竭，左室增大，LVEF<40％。
4.2排除标准：由于意识障碍、智力低下或者言语含糊不能清晰、准确描述病史；除高心病、扩心病之外其他原因所致的慢性心力衰竭；其它系统性疾病(如血液系统，慢性贫血性心脏病，内分泌及代谢原因如甲亢性心脏病等)导致的慢性心力衰竭，病因未得到彻底纠正；可行根治术而未行外科根治术的先天性心脏病；患有其它系统严重疾病如恶性肿瘤、肺病、肝硬化、肾功能衰竭、出血性疾病等、严重的急性感染/代谢紊乱等明显影响患者预期寿命者。
4.3心功能的评价
4.3.1 BNP检测：采用美国Biosite公司Triage快速定量心力衰竭诊断仪，采集静脉全血2 ml，加入EDTA抗凝试管摇匀，取250μｌEDTA抗凝全血加入检测板，放人心力衰竭诊断仪内检测，15 min内显示测定结果，测定单位用pg/ml表示。
4.3.2心脏彩超LVEF：常规心脏彩超检查，检测LVEF值。采用Simpson法测左室舒张末期容量(LVEDV)，左室收缩末期容量(LVESV)，左室射血分数(LVEF)=EDV-ESV/EDV，以上各项指标均连续测量3个周期，使用S3超声探头，探头频率2.5 MH。病人左侧卧位，以美国超声学会推荐的标准平面测得常规结构指标。
4.4心肌能量代谢评价
4.4.1心肌能量消耗MEE测量：患者取左侧卧位，同步记录心电图。使用S3超声探头，探头频率2.5 MH，以美国超声学会推荐的标准平面测量左心室结构指标如收缩末及舒张末内径(LVIDs、LVIDd)、后壁收缩末及舒张末厚度(PWTs、PWTd)等，收缩(LVEF、LVFS)及舒张功能(E/A、EDT、 IVRT)常规指标。各项指标均连续测量3个周期，取平均值。记录患者的身高、体重，用袖带血压计测定收缩压，按公式计算MEE、Tei指数及左室质量 (LVM)、左室质量指数(LVMI)、相对壁厚度(RWT)。
4.4.2双核素心肌代谢显像（DISA-SPECT）：静息状态下静脉注射99Tcm-MIBl740MBq，20min
后进脂餐，40min时测血糖，若血糖为7.77～8.88mmol/L，于60min时静脉注射18F-FDG296~370MBq，120min时行DISA显像。
图像分析：将心肌断层图像分为与超声心动图相应的16个节段，采用半定量法评估心肌的血流及代谢情况：正常(无任何可逆性或固定性放射性异常减低或缺损)--0分，稀疏=1分，明显稀疏=2分，缺损=3分。存活心肌的检测标准为代谢评分较血流灌注评分≤1的心肌节段(灌注低但代谢好，即灌注/代谢不匹配)。
观察指标：各室壁运动异常节段的心肌灌注及代谢评分情况及匹配类型，统计DISA-SPECT检测存活心肌的价值(灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、准确度)。
4.4.3色谱/质谱（GC/MS）分析：准确移取40μl冰水解冻的血清样本至EP管，加入120μl色谱甲醇，涡旋30s后静置30min(4℃)，20000g离心15min(4℃)，取120μl上清液至高回收率样品瓶中，温和氮气吹干，加入80μl的15 mg/ml甲氧胺吡啶溶液，涡旋震荡30s，于37℃反应90 min，然后加入80μl BSTFA试剂(含1％TMCS)，70℃下反应60分钟后进行GC/MS分析。根据文献，检测其中低密度脂蛋白(LDL)、极低密脂蛋白(VLDL)、乳酸(Lactate)、N-乙酰糖蛋白(N-Acetyl glycoprotein)、胆碱(Choline)、磷酸胆碱 (Phosphocholine)、α或β葡萄糖(α-Glucose、β-Glucose)、三甲胺-N-氧化物(Trimethylamine-N-oxide)、甘氨酸(Glycine)、
3-羟基丁酸(3-Hydroxybutyrate)、丙酮(Acetone)、琥珀酸(Succinate)、缬氨酸(Valine)、丙氨酸(Alanine)、谷氨酰胺(Glutamine)、甲硫胺酸(Methiordne)和肌酸(Creatine)浓度。
5.技术路线
6.可行性分析
6.1本项目是关于临床诊断检查方法的研究，申请者及其团队长期从事心血管临床及基础工作，能严格完成病例入组、随访及病例资料的收集；
6.2申请者所在单位为省属三级甲等医院，常规开展心脏多普勒超声、双核素心肌代谢断层显像等检查，保障了入组病例临床资料的完整；
6.3申请者所在单位为南京医科大学附属医院，依托南京医科大学分析测试中心，可以实现色谱/质谱分析,以及研究数据的整理、分析、解释。
6.4本课题组有高级职称1名，中级职称3名，硕士研究生2名，具有良好科研素质、治学严谨、学风端正、有较好的团队协作精神，为本项目的完成提供了有力人员保证。
7.统计学方法
计量资料两组间均数比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
8.研究计划
2015.01～2015.12病例入组、临床资料的收集、临床血清样本的收集
2016.01～2016.06色谱/质谱分析；代谢物的筛选、数据整理
2016.06～2016.12数据分析、解释；论文书写、发表
9.预期研究成果
在国内、国际专业期刊发表论文2篇
南京医科大学第二附属医院申请者郭守玉