消化在线: 曲美他嗪通过抑制自噬减轻心肌缺血
来源：
曲美他嗪通过抑制自噬减轻心肌缺血再灌注损伤的实验研究
立论依据
随着静脉溶栓、经皮冠状动脉腔内成形术及冠状动脉搭桥手术等技术方法治疗急性心肌梗死的广泛开展，急性心肌梗死患者的预后得到明显改善。但是随之而来的心肌缺血再灌注损伤(Ischemia reperfusion，IR)却严重制约着上述方法的救治成功率，增加患者的住院时间、治疗费用并影响患者的预后。因此缺血再灌注损伤机制及心肌保护的研究一直是当今倍受重视的课题。缺血再灌注损伤所导致的最严重后果是细胞的死亡，以往认为坏死和凋亡是IR 所诱导的细胞死亡的主要方式。近年来，一种新的程序性细胞死亡方式--自噬(Autophagy)，即Ⅱ型程序性细胞死亡，越来越受到重视。自噬在心肌缺血再灌注损伤的不同阶段扮演着不同角色，缺血期自噬轻度增加，具有一定的保护作用；但是在再灌注期自噬明显增加，反而加重心肌损伤。种种迹象表明，再灌注后心肌细胞自噬异常增多可能是导致心脏结构和功能损伤的重要启动因素之一。如果能够早期、有效抑制自噬的发生，有望减轻心肌缺血再灌注损伤，甚至减少细胞凋亡的发生。
为了干预心肌缺血梗死及保护心肌，文献报道研究了许多药物如β-受体阻滞剂、自由基清除剂、钙拮抗剂等的心肌保护作用，心肌代谢类药物—曲美他嗪在治疗缺血性心脏病中的有效性和安全性已得到充分证实。它通过直接抑制线粒体长链3-酮酰辅酶Ａ硫解酶（3-KAT），使心肌细胞能量代谢转化为葡萄糖氧化，从而在相同氧耗条件下，能量输出增加和氧自由基产生减少，发挥抗心肌缺血和细胞保护作用。虽然不少研究就曲美他嗪的心血管保护机制进行探讨，已有研究证实曲美他嗪的心肌保护作用可经由PI3K/Akt信号通路转导，但曲美他嗪如何影响细胞内信号通路进而对心肌细胞自噬的影响目前文献报道较少。
本研究以体外培养乳鼠心肌细胞及在体大鼠心肌为实验研究和观察对象，建立缺血再灌注损伤的离体和在体模型，并以曲美他嗪进行干预。观察曲美他嗪对缺氧复氧心肌自噬及自噬相关基因表达的影响，以阐明曲美他嗪通过抑制自噬减轻心肌细胞缺氧复氧损伤的作用及其分子机制，为临床围手术期心肌保护提供新的理论基础和可能的治疗方法。
研究内容及研究方案
研究目标：
本研究以体外培养乳鼠心肌细胞及在体大鼠心肌为实验研究和观察对象，建立缺血再灌注损伤的离体和在体模型，并以曲美他嗪进行干预。观察曲美他嗪对缺血再灌注心肌自噬及自噬相关基因表达的影响，以阐明曲美他嗪通过抑制自噬减轻心肌细胞缺血再灌注损伤的作用及其分子机制，为临床围手术期心肌保护提供新的理论基础和可能的治疗方法。
研究内容：
项目主要实施内容包括四个部分：
一、心肌缺血再灌注损伤模型的制备
（一）离体心肌细胞缺氧复氧（hypoxia reoxygenation, HR）损伤模型的建立
采用差速贴壁方法分离培养乳鼠心肌细胞，利用缺氧复氧培养模拟缺血再灌注损伤。利用MTT法检测大鼠心肌细胞活力及生化分析仪检测培养清LDH释放量变化，验证离体心肌细胞IR模型的有效性。
（二）在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型的建立
成年SD大鼠结扎左前降支(left anterior descending artery, LAD) 30 min模拟心肌缺血后，松线恢复灌注120min。成功标准：结扎LAD后心电图Ⅱ导联ST段出现弓背向上抬高，T波高耸等为缺血成功，放松结扎线后，抬高的ST段下降1/2以上为再灌注成功。通过TTC染色测定各组大鼠心肌梗死面积、全自动生化分析仪检测血清LDH 释放量等方法验证在体IR的心肌损伤作用。
二、曲美他嗪通过抑制心肌细胞自噬减轻心肌缺血再灌注损伤
（一）离体水平曲美他嗪抑制自噬，减轻缺氧复氧心肌细胞损伤的研究
（二）在体水平曲美他嗪抑制自噬，减轻缺血再灌注心肌损伤的研究
分别从离体和在体水平观察曲美他嗪对缺氧复氧心肌细胞的保护作用。利用荧光显微镜技术观察心肌细胞自噬小体变化，并利用流式细胞仪定量检测心肌细胞自噬率的变化，从而明确曲美他嗪是否可以抑制缺血再灌注心肌细胞自噬，发挥其心肌保护作用，并探讨其量效关系。
三、曲美他嗪对缺血再灌注心肌自噬相关基因表达的影响
采用RT-PCR 和Western-blot 等技术，检测曲美他嗪对心肌细胞缺氧复氧损伤后和心肌缺血再灌注损伤后Atg家族的mRNA和蛋白水平变化，从而明确曲美他嗪影响心肌自噬的可能机制。
四、曲美他嗪抑制心肌自噬相关基因表达的信号转导机制
为进一步探讨曲美他嗪是否通过激活Akt通路，抑制心肌细胞自噬相关基因表达，通过给予特异性Akt抑制剂（Akt inhibiter V, tricribine）抑制PI3K/Akt信号通路的激活，采用RT-PCR和Western-blot等技术，观察Atg家族的mRNA和蛋白水平变化，从而明确曲美他嗪是否通过或部分通过PI3K/Akt信号通路，抑制心肌细胞自噬，减轻心肌缺血再灌注损伤，进而保护心功能。
拟解决的关键问题：
1建立缺血再灌注损伤的离体和在体模型；以曲美他嗪进行干预，观察曲美他嗪对缺血再灌注心肌自噬及自噬相关基因表达的影响；
2.阐明曲美他嗪通过抑制自噬减轻心肌细胞缺血再灌注损伤的作用及其分子机制。
拟采取的研究方法、技术路线、实验方案：
在体水平实验
离体水平实验
可行性分析：
1 再灌注后心肌细胞自噬异常增多可能是导致心脏结构和功能损伤的重要启动因素之一。曲美他嗪在心脏生理状态及各种病理改变中发挥着重要作用，特别是近年来的研究发现曲美他嗪能够显著提高心肌细胞损伤后的存活率，减小心肌梗死面积，但其对心肌细胞自噬的影响目前文献报道较少。本项目对曲美他嗪通过抑制自噬减轻心肌细胞缺血再灌注损伤的作用及其分子机制进行研究是前期工作的深入和延续。
2 本项目中所采用的刺激因素皆为国际通用的药物。项目组成员已熟练掌握细胞培养、real time PCR、western blot、ELISA技术和方法。
统计学方法
所有数据以均数±标准差表示。采用SPSS for Window 16.0 软件进行统计分析，两组间进行独立样本t 检验。检验结果以P＜0.05 为统计学差异显著，P<0.01为统计学差异非常显著。
研究计划：
2014-9至2015-3 完成研究内容的第一、二、三部分。
2015-4至2015-10 完成研究内容第四部分。
2015-11至2016-4 整理数据，统计分析，论文发表。
预期结果：
①缺血再灌注可以通过诱导心肌细胞自噬，损伤心肌细胞；
②曲美他嗪能够通过抑制自噬，减轻心肌缺血再灌注损伤；
③曲美他嗪可以通过调控自噬相关基因的mRNA和蛋白表达，影响自噬的发生，并具有浓度依赖性；
④曲美他嗪通过PI3K/Akt信号转导通路调控自噬相关基因的表达。
通过此研究可以得出曲美他嗪可以通过抑制自噬减轻心肌细胞缺血再灌注损伤的结论并阐明其分子机制，为临床围手术期心肌保护提供新的理论基础和可能的治疗方法。本研究完成后，预计可发表SCI论文1篇，培养研究生1名，并利用各种学术会议进行推广。