曲美他嗪改善急性心肌梗死再灌注冠脉微循环障碍的系列研究
立论依据

  急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarcfion，AMI）严重影响人类生命健康，及早恢复心肌灌注是治疗的关键。但是冠脉血流再通并不意味着心肌再灌注的实现。随着冠状动脉介入、溶栓等措施广泛地应用于急性心肌梗死的治疗中，人们发现许多病例尽管其冠状动脉阻塞性病变已经解除，但缺血局部心肌组织灌流并未完全恢复，或无血流灌注，这种称之为心肌“无复流”（No-reflow，NR）现象。近年来，急性心肌梗死再灌注后心肌“无复流”现象是心血管急诊领域一个热点研究问题。其发病机制涉及梗死区缺血性微血管损伤、再灌注损伤、凝血因子激活以及动脉粥样硬化斑块碎片造成微栓塞多个方面。无复流病人易发生心衰、心包渗出，死亡率高。如何使心肌组织及时获得充分灌注，挽救濒临坏死的心肌，减少梗死面积，改善急性期和长期预后，是急性心肌梗死治疗中亟需解决的问题。
     研究表明冠状动脉的无复流现象最根本的原因在于冠脉微循环障碍，改善冠脉微循环已成为当前冠心病治疗领域新的研究热点。一般来说当冠状动脉狭窄程度>50%可导致心肌供血不足，临床诊断为冠心病。然而既往30年来的研究表明，冠脉微循环异常也有可能导致心肌供血不足[1]。微循环是指微动脉和微静脉之间的血液循环，是血液与组织细胞进行物质交换的场所。冠脉微循环是指由微动脉、毛细血管和微静脉构成的微循环系统。冠状动脉主干及其主要分支血管的内弹性膜和中膜平滑肌发达，具有较强的收缩力，能使管腔明显地缩小或扩大，从而调节和分配心脏各部位的血流。而小动脉和微动脉（亦称外周阻力血管，特别是直径<300μm微动脉）仍属肌性动脉，其收缩和扩张可显著影响心肌血流量和冠状动脉阻力的变化，其中冠脉微循环网是冠状动脉主要的阻力血管床和心肌代谢场所[2]。Bonello 等[3]研究结果表明尽管患者经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）术成功后冠脉血流达TIMI3 级，但仍有近30%的病人出现微血管功能异常。有研究发现尽管ST段抬高性心肌梗死（STEMI）患者在急诊接受PCI术治疗后冠脉血流恢复正常，但仍有较大部分病人因冠脉微血管损伤和功能异常导致预后不佳[4]。随着研究的不断深入，人们逐渐认识到冠脉微血管功能异常是许多心脏疾病病理生理的一个重要机制，因此有必要准确评估冠脉微循环功能状态，以及改善患者冠脉微循环对患者长期预后可能带来的潜在益处具有十分重要的研究价值和临床意义。
    在正常及绝大多数病理情况下，冠状动脉血流阻力主要来自于直径<500μm的前小动脉及直径<200μm的小动脉。前者仍然属于心外膜血管或心肌外血管，对血流切应力及血管内压力发生作用以维持对远端小动脉床足够的灌注压，占总冠状动脉血管血流阻力的25%。小动脉位于心肌内，在冠状动脉循环起重要的调节作用，约占整个冠状动脉血流阻力的55%。小动脉按照其直径及张力调节机制，通常分为3类：内皮依赖的血管反应主要产生于直径100-200μm的大的小动脉中，根据血流变化对血管活动进行调节；位于直径40-100μm中等大小的小动脉血管平滑肌上牵张感受器，对管腔内压力变化做出反应，当管腔内压力增加时，血管收缩；压力降低时，血管扩张，又称肌源性控制；直径<40μm的微小动脉主要为心肌的代谢活动所控制。当心肌代谢增加时，微小动脉舒张，使中等大小的小动脉管腔内压下降，产生肌源性血管舒张，从而进一步使血流量增加，导致内皮依赖性的血管舒张，藉此实现心肌微循环对心肌灌注有效和高效的调节，来满足不同代谢水平心肌对能量供应的需求［5］。基于此理论，我们推测通过改善心肌整体代谢状态以及优化冠脉的微小动脉的能量利用，从而达到调节冠脉微循环状态，减轻冠脉无复流的作用，目前国内外相关研究尚少。
曲美他嗪是一种哌嗪类衍生物，能够通过改变心肌细胞能量合成途径，即促进葡萄糖氧化，抑制脂肪酸氧化，从而改善心脏能量代谢[6]。为使心肌保持正常的收缩功能和离子稳定状态，心脏需要产生大量的ATP以供应能量，心脏可以利用葡萄糖、脂肪酸、酮体、乳酸等底物产生ATP [7、8]。在正常情况下，线粒体氧化磷酸化合成超过95%的ATP，5%来自糖酵解[9]。而在心肌缺血缺氧条件下，有氧氧化受抑制，ATP产生不足，Na-K-ATP酶活性受抑制，细胞内Na+增多，无氧酵解增强，乳酸堆积，造成H+蓄积，细胞内酸中毒，Na-H 交换被激活，也使细胞内Na+增多，进而激活Na-Ca 泵，造成钙超载，线粒体内Ca2+聚积可引起膜通透性改变，导致线粒体肿胀，造成细胞不可逆的损伤。当再灌注时，大量氧供虽能使线粒体呼吸链功能有所恢复，但也可引起大量氧自由基产生和细胞内Ca2+聚积，钙超载可激活磷脂酶，进一步加重膜损伤。动物实验[10]证明：曲美他嗪能减轻线粒体内钙聚积，保护线粒体氧化功能，抑制Ca2+引起的线粒体肿胀；曲美他嗪可通过提高自由基清除酶活力，抑制氧自由基对细胞膜脂质过氧化反应，稳定膜的结构，减少细胞内酶的漏出，发挥对心肌缺血的保护作用。心肌缺血后能量利用障碍会影响心肌的收缩功能，心肌缺血后三磷酸腺苷(ATP)和磷酸肌酸(PC)含量下降。曲美他嗪可以减轻缺血再灌注损伤除了上述心肌保护机制，是否改善了冠脉的微循环状态，目前国内外尚未见相关报道。
临床实践证明，无论单用或联用曲美他嗪均能显著延迟运动所致心绞痛发作时间，减少心绞痛发作次数，延迟运动所致ST段下降1 mV的时间，显著提高缺血发作阈值，增加缺血再灌注时心肌能量的生成，改善休息和运动时的左室收缩功能，增加心脏运动耐量，并且不伴血流动力学参数(如HR、SBP)的改变，无负性肌力作用[11]。Guler等[12]采用亚极量运动试验方法评定曲美他嗪对急性心肌梗死的作用，发现曲美他嗪可以提高心肌梗死患者运动耐量和降低缺血发作次数。另外也有学者的研究表明曲美他嗪能够促进心肌梗死后左室收缩和舒张功能的恢复[13]。目前相关研究显示曲美他嗪可以改善心肌梗死患者预后及提高缺血性心脏病患者的运动耐量，但其确切机制尚不十分清楚。本研究拟从微循环角度探讨曲美他嗪对急性心肌梗死患者心肌灌注水平的影响，以及长期预后的改善。通过研究曲美他嗪对心肌梗死面积及心功能的影响，与心肌梗死患者运动耐量的改善，阐明改善心肌梗死患者的冠脉微循环的重要性具有十分重要的意义。

参考文献：
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研究内容及研究方案
1.研究目标
本研究共分两部分，第一部分通过建立急性心肌梗死无复流实验动物模型，通过应用曲美他嗪药物进行干预，研究优化能量代谢治疗对急性心肌梗死无复流心肌面积以及微小动脉的影响，探讨曲美他嗪能否通过改善冠脉微循环状态，减小心肌梗死的面积。第二部分，研究经曲美他嗪干预的行择期PCI的急性非ST段抬高心肌梗死的患者，观察其研究期间心绞痛控制率，心肌灌注水平以及运动耐量及心脏不良事件的发生率，进一步阐明曲美他嗪干预心脏能量代谢，能否通过改善患者心肌微循环灌注水平，改善心肌梗死患者的运动耐量、心功能水平及长期预后。

2.研究内容
第一部分：曲美他嗪对急性心肌梗死无复流面积及冠脉微循环的影响。
     选取健康SD大鼠，应用结扎冠状动脉前降支方法制备急性心肌梗死大鼠动物模型。研究曲美他嗪药物干预对心肌梗死面积、无复流面积以及冠脉微小动脉的影响。观察指标：心肌梗死面积、无复流面积、微小动脉直径及数量。

第二部分：曲美他嗪对急性非ST段抬高心肌梗死行择期PCI患者的心肌灌注水平及运动耐量的影响。
入选符合入选标准的急性非ST段抬高心肌梗死行择期PCI患者，术前给予曲美他嗪药物治疗，观察PCI术后即刻心肌校正TIMI血流帧数计数及TIMI心肌灌注分级。术后24小时行实时心肌声学造影（MCE）观察心肌微循环灌注水平的变化。并分别于术后1个月随访心脏彩超及运动平板负荷试验。


3.拟解决的关键问题
（1）研究急性心肌梗死发生无复流现象时冠脉微循环的变化，研究表明冠脉微循环受代谢水平调节，那么优化能量代谢能否达到改善微循环的目的？
（2）急性心肌梗死患者行PCI治疗开通冠脉大血管对冠脉微循环的影响如何? 改善心脏能量代谢是否会改善心肌的灌注水平？心肌能量代谢及冠脉微循环的改善能否改善心肌梗死患者的运动耐量及长期预后？
      以上问题的阐明，将为心脏能量代谢药物曲美他嗪的临床应用提供新的治疗靶点，为心肌梗死的治疗及冠脉无复流现象的防治，以及改善冠脉微循环障碍的治疗方面提供重要的基础及临床证据。
技术关键：
（1）成功建立急性心肌梗死无复流动物模型，准确复制出冠脉无复流现象。
（2）应用Thioflavin-S及Evans-B1ue染色法测定心肌梗死无复流面积，墨汁灌注法测定冠脉微小动脉直径及数目。
（3）应用实时心肌声学造影（MCE）检测心肌灌注水平。应用运动平板试验评价患者活动耐量水平。

4.研究对象与方法
第一部分：曲美他嗪对急性心肌梗死再灌注无复流面积及冠脉微循环的影响
（1）实验动物分组及心肌梗死再灌注模型的建立
     选取健康SD大鼠60只，雌雄不限。分别测量体重（BM）、心率(HR)后，随机分为2组(每组30只)：对照组、实验组；实验组给予曲美他嗪5mg/Kg/d，灌胃1周，对照组给予同等剂量安慰剂，建立急性心肌梗死无复流动物模型。实验动物麻醉后，气管切开，接呼吸机辅助呼吸。打开胸腔，切开心包膜，暴露心脏，于冠状动脉左前降支近段将结扎线穿入一长0.5-1.0 cm的硅胶管腔内结扎。以结扎区局部心肌颜色变暗，I、aVL、V1-V3导联心电图出现ST段持续抬高并与T波形成单向曲线作为结扎有效。90 min后切断结扎线，并根据局部心肌颜色变化证实再灌注，持续灌注120 min。
（2）无复流面积及心肌梗死程度的测定
    每组各取15只大鼠，按1 ml/kg从左心室注入6％Thioflavin-S。再于原位重新结扎左前降支，从左心室注入Evans-Blue，使非结扎区着蓝色，结扎区不着蓝色。取出心脏，并沿心脏长轴做心肌横断面切片，放置于紫外光灯下，可见无复流区为荧光缺损，有复流区为荧光闪亮。最后将整个心肌切片置于质量浓度为1％的氯化三苯基四氮唑磷酸缓冲液(pH=7.4，TTC)中，溶液置于37℃水浴温箱中放置20 min。梗死心肌不着色，非梗死心肌被染成砖红色。以上各步分别用数码相机拍照。心肌无复流程度、梗死程度的测定：将拍照的各断面图像输入计算机，多功能真彩病理图像分析系统测量各组心肌标本。测量缺血区(即结扎区，无蓝色区)、无复流区(荧光缺损区)和梗死区(非砖红色区)。心肌无复流程度(％)=(无复流区/缺血区)×100％；心肌梗死程度(％)=(梗死区/缺血区)×100％。
（3）冠状动脉微循环形态观察
每组各取15只大鼠，采用墨汁灌注法，由心尖偏左进针，穿人左心室，在不超过90-110mmHg压力下灌注生理盐水，剪开一叶肺脏，观察流出液至呈无色透明时，停止冲洗，再改灌墨汁灌注液(由墨汁与低分子右旋糖酐7:3的比例配制而成)，直至全身逐渐显示均匀暗灰色。结扎进出心脏主要动静脉后，解剖取出心脏，置于10％福尔马林中固定，分别于30％、50％、70％、85％、95％、100％乙醇常规脱水，甲醇乙脂透明3-5 d。在与心肌纤维走行相垂直的方向切取包括缺血区在内的左右心室心肌，石蜡包埋切片，切片厚度30μm，以甲醇乙脂铺片后，中性树脂封片。在高倍镜(40×10)网格式目镜测微尺下计数(20×20μm2)内毛细血管的数目(镜下呈黑色点状)。每个部位观察3个视野，取均数，并作显微摄影。

第二部分：曲美他嗪对急性非ST段抬高心肌梗死行择期PCI患者的心肌灌注水平及运动耐量的影响
（1）研究对象入选及分组
选取发病24小时内的诊断符合急性非ST段抬高心肌梗死诊断标准的患者80例并在住院期间接受冠状动脉造影（CAG）检查有PCI指征，患者及家属同意PCI治疗的患者为研究对象。采用随机数字表法分为对照组和曲美他嗪组，对照组给予常规药物治疗，曲美他嗪组在常规药物治疗的基础上加用曲美他嗪20mg日三次服用，所有患者均为入院10天后择期行PCI治疗，因病情不稳定行急诊PCI患者剔除本研究。所有患者均知情同意，本研究通过本单位伦理委员会审核批准。
（2）冠状动脉血流速度及心肌灌注观察
采用PHILIPS FD-20数字减影血管造影机。经桡动脉途径行冠脉造影，采取多体位的投照角度得到清晰的图像。记录造影时间约3-5个心动周期，并能够清晰地显示造影剂在心肌组织中的灌注相及排空相。由两位有经验的医师对造影结果进行判定，明确缺血相关血管。采用计算机辅助冠状动脉造影定量分析（quantitative coronary analysis, QCA）系统精确测定冠状动脉狭窄病变程度，对狭窄程度≥75%血管病变直径处行支架植入治疗。记录介入治疗前后两组患者病变相关血管的心肌梗死溶栓试验（TIMI）血流分级以及支架后的校正TIMI帧数（CTFC）、TIMI心肌灌注分级（TIMI myocardial perfusion grade, TMPG）等指标。
（3）应用心肌声学造影对心肌灌注的观察
所有入选患者于行PCI术后24小时行实时心肌声学造影（MCE）：于肘正中静脉以1mL/min的速度在2 min之内匀速推入声学造影剂，然后将5 mL生理盐水同样速度由静脉注入。记录造影剂充盈的时间、心肌各段造信号强度等，并记录动态显像。造影剂在心肌内显像稳定后，启动彩色多普勒成像技术，间断使用高机械指数1.7超声发射破坏心肌中造影剂微泡。心肌内的造影剂基本破坏后，降低机械指数0.1，观察心肌再充盈的过程。在胸骨短轴心尖切面、胸骨乳头肌段、胸骨短轴二尖瓣段、心尖两腔心切面、心尖四腔心切面观察灌注情况。二维超声心动图及MCE 均连续动态采集图像，由两位独立的观察者对结果进行分析。图像分析:根据美国超声心动图学会建议，左心室壁分为16节段。心肌造影计分（MCS）:1 分 心肌回声均匀增强，0.5分 回声不均呈斑片状，0分 无心肌显像。声学造影记分指数（Contrast score index，CSI）定义为与再血管化相关节段的心肌造影评分之和除以节段数之和。
（4）运动平板试验对患者活动耐量的观察
所有入选患者于行PCI术后1个月行运动平板试验检查，采用Bruce方案，运动前首先记录12导联心电图、血压、心率及症状，运动中及运动后连续同步监测12导联心电图、血压、心率，并记录症状。运动终点是：（1）达最大目标心率（220-年龄）85%以上；（2）出现典型心绞痛；（3）出现严重心律失常；（4）心率在1min内减少20次，收缩压下降20mmHg以上[1]；（5）心电图出现阳性结果；（6）体力不支不能坚持运动。阳性标准：（1）运动中出现典型心绞痛；（2）运动中或运动后心电图出现ST段水平或下斜型（J点后80ms）下移≥0.1mV，持续时间≥2min；（3）出现严重心律失常，如多源频发室性早搏、室性心动过速、心房颤动、窦房传导阻滞、房室传导阻滞。
5.技术路线

第一部分：曲美他嗪对急性心肌梗死再灌注无复流面积及冠脉微循环的影响
第二部分：曲美他嗪对急性非ST段抬高心肌梗死行择期PCI患者的心肌灌注水平及运动耐量的影响
统计方法：
所用数据输入SPSS15.0统计软件包进行统计，符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，多组均数采用方差分析检验。相关分析用r检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

6.实验方案及可行性分析
本研究分基础与临床两部分，基础实验研究方面，课题组成员具有丰富的制备急性心肌梗死缺血再灌注模型的经验，以及组织染色、标本制备技术方面具有丰富的经验，故本实验技术上是可行的。既往研究表明心脏微小动脉及微循环状态受代谢水平调节，改善心肌代谢状态必将对心肌微循环带来有益的影响。故本研究设计理论上是可行的。临床研究方面，本课题团队具有丰富的PCI治疗及读片经验，以及超声科技师对于心肌声学造影技术能够熟练运用。运动试验来评价患者活动耐量简单易行，安全性高，故本实验的设计合理，可行性较高。

7.研究计划及预期研究成果
研究计划：
2015.01—2015.12  动物模型制备，标本留取，临床病例收集
2016.01—2016.12  标本留取，临床病例收集，数据整理
2017.01—2017.03  统计分析、发表论文、申报成果

预期研究结果
(1) 明确急性心肌梗死发生无复流现象时心肌微循环状态的变化特点。
(2) 揭示优化能量代谢治疗对心肌梗死无复流面积及微循环的影响机制。
(3) 研究改善心脏能量代谢对急性心肌梗死患者冠脉微循环灌注的影响。
(4) 明确心肌能量代谢及冠脉微循环的改善能否改善心肌梗死患者的运动耐量及长期预后。
(5) 为能量代谢药物曲美他嗪的临床应用开发新的适应症，为其在缺血性心脏病治疗领域提供新的基础及循证医学证据。
(6) 预期发表研究论文4-6 篇，其中2 篇以上SCI 收录论文，培养硕士生2-3名。并申报科技成果奖。