作者：王玉明  张晓琦

作者单位：南京大学医学院附属鼓楼医院

【摘要】炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一种病因和发病机制尚不明确的慢性非特异性肠道炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病 (Crohn's disease, CD)。间充质干细胞（MSC）是一种具有多分化潜能的细胞，有归巢、组织修复和免疫调节功能。基于其强大的免疫调节及刺激组织修复功能，越来越多的研究将MSC用于IBD治疗，本文将对间充质干细胞治疗IBD现状及目前尚需明确的问题作一综述。

【关键词】间充质干细胞   溃疡性结肠炎   Crohn病  干细胞 炎症性肠病

Research progress of mesenchymal stem cells in the treatment of inflammatory bowel disease

【Abstract】Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic and non-specific intestinal inflammatory disease that the pathogenesis is still not clear, which includes ulcerative colitis (UC) and Crohn’s disease (CD). Mesenchymal stem cells (MSC) are cells with multipotent differentiation capacity and are capable of selectively homing to inflammation areas for tissue healing and immunoregulation. Based on its strong immune regulation effect and radical repair, MSC is increasingly used in the treatment of IBD in recent years. In the review, we will focus on the status of MSC in treatment of IBD and existing main problems.

【Key words】Mesenchymal stem cells； ulcerative colitis； Crohn Disease；stem cells; Inflammatory bowel disease

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是基因、免疫和环境等多因素参与的复杂慢性复发性疾病[1,2]。促炎T辅助细胞（Th1 / Th17）和调节T淋巴细胞（Treg）失衡，巨噬细胞和B细胞激活及白细胞趋化募集等，在IBD发病中起关键作用。

间充质干细胞（MSC）是具有多向分化潜能和自我复制功能的原始细胞，除了多谱系分化和参与造血干细胞壁龛形成外还具有免疫调节作用，包括抑制Th1和Th17细胞功能及增值并促进Treg分化。此外还有几种特性决定MSC可促进组织修复：如归巢到炎症和组损伤组织，分化成多种细胞类型，分泌可溶性因子刺激受损的细胞和组织存活及修复等。因此，越来越多研究将MSC用于IBD的治疗，大量的文献报道证明其安全、有效、可行，并在国内外均得到一定程度的认可[3]。本文主要对MSC治疗IBD研究进展以及目前临床应用所面临的主要难题作一综述。 

1.MSC定义及其功能

间充质干细胞不同于骨髓造血干细胞，其来源广泛，除了骨髓也可以从脐带、脐带血、胎盘、脂肪组织、牙髓等组织中分离，大多数在器官的结缔组织中[4]。适宜培养条件下，MSC 可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和间质细胞。国际细胞治疗协会（ISCT）于2006年制定了多功能MSC的基本定义：（1）贴壁性；（2）表达基质细胞抗原（CD105，CD73，CD90），不表达造血细胞表面抗原（CD45，CD34，CD14，CD11b，CD79a，CD19 和HLA-DR）；（3）体外培养可以分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞[8]。MSCs被认为是低免疫原性的，因为它们表达低水平的HLA I类分子，并且在正常情况下不表达HLA II类或共刺激分子（CD80，CD86或CD40）[5]。

MSC的免疫调节具有多效性，目前尚未完全了解。MSCs首先被证实可抑制T细胞增殖。高MSC/T细胞比率抑制增殖，而低MSC/T细胞比率可能促进T细胞增殖。近期研究发现DSS诱导的结肠炎鼠模型输注骨髓MSC后，通过Fas配体 - / Fas途径诱导T细胞凋亡[6]。MSC可募集Treg，主要通过分泌可溶性因子（如PG-E2、TGF-b1、HLA-GT）以及诱导未成熟的树突状细胞和单核细胞分化成调节谱系 [7]。体内实验亦证实，结肠炎小鼠注射MSC后肠系膜淋巴结和结肠中产生IFN-c的Th1细胞减少而Treg细胞增加，且促炎细胞因子/抑炎因子比例下降 [8，9]。

MSC可选择性迁移至组织损伤和炎症部位[10]，但保持时间目前未知，大多数研究MSC跟踪分析仅在注射后的第一周内，唯一一项研究跟踪分析到注射后15天，结肠炎症组织仍可发现MSC[11]。调节MSC迁移的信号包括生长因子如血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子等 [12]，且MSC表达不同粘附分子参与组织转移，如细胞间粘附分子（ICAM）、血管细胞粘附蛋白（VCAM）和整合素[8] 等。IFN-c或IL-1b激活可通过VCAM抗体靶向结合促进MSC归巢到肠系膜淋巴结和结肠[13]。

MSC可分化成间充质谱系的各种细胞，并且能够移植入组织，促进组织修复[14]。DSS诱导大鼠结肠炎静脉注射大鼠MSC后，可迁移到损伤结肠固有层，调节α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达、促进损伤粘膜上皮愈合。MSC的组织修复能力主要通过刺激血管生成和抑制损伤组织凋亡和纤维化，进而促进局部组织存活和恢复。MSC还可增加肠上皮细胞增殖和肠干细胞的分化[15]。TNBS诱导结肠炎大鼠局部植入大鼠骨髓MSC后第3天和第6天，粘膜下层中可检测到MSC，小部分MSC的a-SMA和desmin呈阳性，表明其分化成肌成纤维细胞，大部分表达胃肠道伤口愈合中两种重要的生长因子VEGF和TGF-b1[16]。MSC还通过恢复紧密连接蛋白及claudin-2, claudin-12 and claudin-15的表达修复肠黏膜屏障[17]。 

2.MSC治疗IBD的临床应用

目前采用同种自体和异体MSC的治疗均有报道，且主要以两种方案用于临床IBD治疗：局部注射治疗克罗恩病肛瘘和静脉注射治疗腔内克罗恩病或溃疡性结肠炎。 

2.1 MSC治疗克罗恩病相关肛瘘

CD相关肛瘘很多对常规治疗无反应，外科手术治疗可以治愈一部分，但肛门失禁和复发等并发症并不少见；即使使用生物制剂治疗，此类肛瘘管理仍然是一个具有挑战性的问题。一些I期或II期试验已证实局部注射自体或同种异体脂肪或骨髓MSC治疗CD相关肛瘘有效、安全。尽管MSC来源、注射剂量和注射方案不同，研究结果均显示自体或异体MSC对于克罗恩病相关肛瘘有一定疗效。

迄今为止，已超过200名克罗恩病相关的难治性肛瘘患者接受MSC局部注射治疗，超过一半患者完全缓解，其中约75％可持续至少24周，至少三分之二对治疗有反应。目前有8项I-III期局部注射自体或同种异体脂肪组织来源或骨髓MSC治疗克罗恩病相关肛瘘的临床试验完成，还有5项正在进行中。

一项欧洲多中心随机双盲临床III期试验（ADMIRE研究）中，212例非活动性CD相关难治复杂活动性肛周瘘患者，除了原有基础治疗，单次注射120×10^6自体脂肪组织来源MSC或安慰剂至所有瘘管邻近组织并手术闭合内部开口，24周后，MSC组较对照组更多实现瘘管闭合（53/107 vs. 36/105，P=0.024），且临床缓解需要的时间更短（6.7 vs. 14.6周），MSC组17.5％患者有相关不良事件，安慰剂组为29.4％，最常见为肛门脓肿和肛周疼痛[18]。在今年2月举行的第12届ECCO年会上，作者进一步汇报了随访至52周的结果，治疗组和对照组的瘘管闭合率分别为56.5%和38.6%（P=0.01）。

2.2 MSC治疗肠道IBD

静脉注射自体MSC治疗仅有两项小的临床试验，而同种异体MSCs较多。已经有31项同种异体MSC全身输注以治疗难治性腔内克罗恩病或溃疡性结肠炎研究报道，约60％患者临床应答，40％达到临床缓解，目前还有7例临床试验主要使用同种异体脂肪组织衍生、骨髓或脐带MSC正在进行。但这些研究普遍纳入病例数不多，其长期疗效仍有待进一步观察。 

3.0面临的主要问题

3.1 MSC的来源

大多数CD相关肛瘘的临床试验均用脂肪组织来源的MSC[19,20]，只有两项研究使用骨髓MSC[21,22]，肠道CD或UC主要用骨髓或脐带MSC治疗CD [19]。越来越多证据表明，骨髓、脂肪组织来源和脐带MSC之间具有一定差异，包括其免疫调节效应。几项体外实验研究表明，脂肪组织来源和脐带MSC抑制免疫的作用可能优于骨髓MSC[23]。

自体和同种异体MSC对克罗恩病治疗均有一定疗效，在治疗肠道CD患者的临床研究中似乎同种异体MSC比自体MSC更有希望。然而，也有体外试验发现，CD患者MSC与健康供体的MSC具有相似的生长潜力和抑制T细胞特性[19]，CD患者的脂肪MSC对DSS诱导的结肠炎小鼠也有一定的治疗效果。对于不同IBD，究竟何种来源的MSC治疗效果会更好，可能还需要进行更多的临床研究。

3.2剂量和注射方式

目前的临床研究，对于CD相关瘘以局部注射为主。其它一般采用静脉注射或经肠系膜动脉介入注射的方式。静脉注射易行、微创和安全，但真正能够到达肠道炎症部位的MSC比例没有确切的评估报告。肠系膜动脉介入注射MSC可以增加到达炎症部位的细胞量，但这种途径具有一定侵入性，需要专门的介入医生在X线下进行操作，且疗效相对于静脉输注优势很小。

在两项小型研究中,以不同剂量和给药方案静脉输注MSC，似乎结果并没有太大差异[20]，无论单次注射或重复注射MSCs结果均有效，但缺少长期随访数据。在治疗CD肛瘘中，注射的MSC数量根据试验设计变化，但是注射方案相对恒定：多数选择单次注射MSC，个别在6-8周瘘管不完全闭合的情况下二次注射相似或更高剂量的细胞数，且大多数瘘管改善或愈合持续至1年，不论MSC的数量多少，结果均有效。最近一项临床II期试验中1×10^7或3×10^7MSC的组比9×10^7MSC组相比效果更佳[22]。因此，MSC的最佳剂量、最佳治疗时刻表尚待确定。

3.3 MSC的体外处理。

动物试验发现，IFN-c预处理的MSC表现出更有效的免疫抑制作用，治疗结肠炎更有优势[13]。但最近一项用IFN-c预处理MSC治疗难治性儿童CD的研究发现其无效[24]。

常规培养使用胎牛作为血清生长因子的来源，胎牛血清蛋白可被MSC内化，在MSC治疗的患者血清中可检测到抗胎牛血清抗体，这可能触发体内MSC的免疫反应和MSC裂解[111]。人血小板裂解物可促进伤口愈合，将人脐带血衍生的血小板裂解物与来自CD患者的脂肪MSC共注射可增强MSC治疗效果[112]。对于刺激MSC增殖，人血小板裂解物优于胎牛血清，且不损害MSC的免疫抑制效应，但对趋化因子受体和整合素表达的影响仍有待研究。

如上所述，MSC组织修复效果受其归巢到炎症部位能力限制，局部或全身给药后MSCs持续时间仍然存在争议。在心肌梗死、肺纤维化或糖尿病性勃起功能障碍的几种动物模型中，缺氧条件下或用抗氧化分子（例如高密度脂蛋白，姜黄素）预处理MSC，可增加CXCR4趋化因子的表达及其生存能力，促进其归巢和植入[25]。这些方法应同样可用于IBD的研究，以便改善总体反应比例和持续时间。

3.4 安全性评估

目前为止，无论是IBD患者的临床试验，还是其它疾病的MSC治疗，都没有MSC相关严重不良事件的报道。荟萃分析显示，在注射期间或注射后即刻出现的短暂低热可能和MSCs相关[26]，但没有组织异位生长与局部注射相关。尽管MSC可抑制免疫，但并不增加感染或恶性肿瘤的风险[27]。目前尚缺乏长期随访的临床试验，明确评估MSC治疗的安全性。 

结论

基于MSCs的免疫调节效应、促进组织修复能力，其治疗免疫失调导致组织损伤引发的IBD是有希望的。目前，克罗恩病肛瘘患者的临床试验结果令人惊喜，几项随机对照实验已证实MSC对常规或生物治疗无效克罗恩病肛瘘患者有一定疗效。为了评估MSCs对IBD的疗效，以临床缓解和内镜评估改善作为终点的II期和III期研究还需进行，MSC的最佳来源以及注射剂量和方式仍待确定，更多的试验应以此为目标，以便能更好利用MSC的巨大潜力治疗IBD。

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