作者：王景晖 沈骏 冉志华 

作者单位：上海仁济医院

摘要：

        炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）是一种病因尚不明确的慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn's disease，CD）。已有研究表明肠黏膜屏障的破坏与其发病有关。肠黏膜屏障是保护肠道免受肠道内容物侵袭和粘附的第一道也是最重要的防线。本文从肠黏膜屏障的各个成分，如完整的肠道上皮、各种抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）的合成、黏液层的形成等方面，分别介绍其与炎症性肠病发病的关联。肠黏膜屏障的破坏包括AMPs形成缺陷、黏液层成分和厚度的改变、模式识别受体（pattern-recognition receptors, PRR）的改变、自噬性溶酶体缺陷和内质网应激的改变，这些在IBD的发病中起着重要的作用。另外，本文也对目前针对肠黏膜屏障破坏的检测方法作简单介绍。

关键字：炎症性肠病，抗菌肽，模式识别受体，黏膜层，自噬

 INTESTINAL BARRIER IN INFLAMMATORY BOWEL DISEASE AND THE DECTION OF THE BARRIER

 ABSTRACT

        Inflammatory bowel disease (IBD) including ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD) is a chronic inflammatory disease ofthe colon and small intestine whose pathogenesis is unclear. There are studies suggest that the disturbances of the intestinal barrier contributes to the inflammatory bowel disease. A complex intestinal barrier protects as the first line of defense the surface of the healthy intestinal tract from invasion and adhesion from the luminal microorganisms. This review provides an overview about the major components of this protective system such as the epithelium, the antimicrobial peptides (AMPs) and the formation of the mucus layer. Barrier defection including alterations in composition or thickness of the intestinal mucus layer, a defective production of AMPs, mutations of pattern-recognition receptors (PRR), alterations in the process of autophagy induce an inadequate host protection and are thought to play an important role in the pathogenesis of the inflammatory bowel diseases. Moreover, in this review we provide a brief introduction of the detection of the intestinal barrier.

Key words: inflammatory bowel disease, epithelium, antimicrobial peptides, pattern-recognition receptors, mucus layer, autophagy

绪论

        肠道除了广为人知的消化和吸收功能外还有一项任务。肠道内寄生着大量的微生物，正常情况下，这些微生物并不致病，反而帮助肠道更好地完成消化和吸收功能，这些是建立在完整的肠道屏障和肠道免疫平衡的基础上的。宿主必须提供一个能和这些寄生菌共存的环境，一方面要避免针对共生菌的过度免疫反应，另一方面要对致病菌要及时地检测和消除。为避免致病菌的侵袭和黏附^[1]，肠道黏膜层覆盖了一层复杂的屏障结构。这层屏障保护肠道黏膜免与肠道致病菌正常接触，从而维持正常的肠稳态。

        炎症性肠病的发病率逐年增高，已成为一种不可忽视的肠道疾病。目前的研究发现炎症性肠病与肠黏膜屏障的破坏有着密切的关系。本文主要介绍肠黏膜屏障的破坏在炎症性肠病发病中的作用及肠道屏障的检测。

肠黏膜屏障的的生理功能

        正常肠黏膜屏障主要由四个层面组成，分别是机械屏障、化学屏障、免疫屏障、生物屏障^[2]。机械屏障是指完整的上皮细胞及细胞间连接（包括紧密连接、黏附连接、桥粒^[1]）；化学屏障由胃肠道分泌的胃酸、胆汁、各种消化酶、溶菌酶、黏多糖等化学物质及肠道寄生菌产生的抑菌肽（AMPs）组成；免疫屏障由肠道内分泌型IgA（sIsA）及广泛分布于肠道黏膜内的淋巴组织构成；生物屏障由共同寄居在肠腔内或定植于肠黏膜表面的肠道常驻菌群形成。肠黏膜屏障其实承受着两种截然不同的生物压力，一方面要在与肠腔内大量共生菌群相互作用的过程中保持免疫静默，同时还要应对致病菌黏附和侵袭的挑战。

肠黏膜屏障在炎症性肠病中的作用

        IBD的特征是细菌侵入黏膜层，并诱导针对肠道正常菌群的持续的、过度的免疫反应。肠道黏膜屏障的缺陷会影响固有免疫系统，而不同类型的屏障缺陷分别与不同类别的IBD的发病有关^[3]。

黏液层与抗菌肽

        在肠道上皮表面覆盖着有保护作用的黏液层，它是由蛋白质、碳水化合物、脂质和大量的水组成的。粘蛋白（mucin）对形成黏液层起重要作用，其中最主要的是MUC2，它主要由小肠和大肠的杯状细胞分泌^[4]。通过形成多聚体复合物，MUC2形成了黏液层的主要结构单元^[1]。小肠上皮覆盖着单层黏液层，这层黏液层并不与上皮细胞紧贴；大肠上皮覆盖着两层黏液层，内层与上皮细胞紧贴，而外层是可活动的^[1]。

        抗菌肽是先天性免疫的重要组成部分，抗菌肽可以保护深层的黏液层免受肠道内容物的影响，保持相对无菌的环境，因而避免黏液层下的组织产生炎症反应。目前研究较多的抗菌肽是防御素，防御素分为α防御素和β防御素。α防御素主要由潘氏细胞分泌，而β防御素主要由肠上皮细胞和杯状细胞分泌^[5]。 α防御素有6种，其中的HD-5和HD-6与小肠有关，HD-5和HD-6在小肠中由潘氏细胞大量分泌，在大肠中缺失，它们对多种细菌有很强的杀伤能力^[6]；β防御素主要是上皮来源，在肠道、呼吸道、皮肤中都有存在^[1]，HBD-1是持续性表达的，而其它的β防御素比如HBD-2有随致病菌或炎症而上调的特点，同时HBD-2也可被益生菌所诱导^[3]。

        黏液层有结合并维持抗菌肽的作用，这两者共同构成了肠道黏膜屏障的最外层，在保护肠道上皮免受细菌侵袭和粘附的过程中起着重要作用^[3]。

        有研究表明，发生在小肠的CD与潘氏细胞功能的减弱及HD-5和HD-6水平下降有关^[7]；发生在结肠的CD与β防御素减少有关，比如持续表达的HBD-1的水平下降，可诱导表达的HBD-2的可诱导性下降^[3]；UC的发生与黏液层的变薄甚至缺失有关，因为黏液层有结合并维持抗菌肽的作用，所以在UC中即使抗菌肽的表达上调，黏液层的抗菌能力也会大大地下降。抗菌肽或者黏液层功能的缺陷使得肠道细菌能够穿过黏液层粘附到上皮细胞上，通过各种信号通路（详见下文）招募炎症免疫细胞，诱发过度的适应性免疫过程，最终形成慢性炎症^[3]。

模式识别受体

        模式识别受体（PRR）是在肠道上皮细胞和免疫细胞中都有表达的一类蛋白质，它能识别在微生物中一致性表达的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMPs）。PRR主要分为两类，分别是Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs) 和NOD样受体（NOD-like receptors，NLRs）^[8]。PAMP-PRR监测肠道细菌的通路在健康的肠道屏障中起着重要作用，一旦PRR被它们相应的配体激活，细胞就会产生快速而持续的一线防御反应，包括粘蛋白的产生、抗菌肽的产生和释放以及相关的信号分子通路的激活，进而招募急性炎症反应细胞产生炎症^[3]。

        NOD样受体是一类胞质受体，主要针对进入细胞内的病原体^[8]。这类受体有类似的分子结构，羧基端有亮氨酸重复（leucine-rich repeat, LRR) 序列，中央有核苷酸结合低聚反应（nucleotide binding and oligomerization, NOD）序列，氨基端大多与信号通路的激活有关。NOD2是NOD样受体家族中的一员，其在CD的发病中起着重要的作用^{[1, 9]}。NOD2的氨基端包含两个半胱氨酸蛋白酶激活和招募区域（caspase activating and recruiting domains, CARD），可以激活核因子活化B细胞κ轻链增强子（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells， NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路。

        正常情况下，表达在肠道黏膜下的巨噬细胞和树突状细胞上的NOD2识别细菌产物胞壁酰二肽（muramyl-dipeptide，MDP）之后发生构象改变，通过一系列信号分子传导，激活NF-κB和MAPK信号通路。NF-κB和MAPK信号通路的激活导致多种固有细胞因子的分泌，包括促炎症因子（TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8等）、黏附分子（ICAM-1、VCAM-1、E-选择素和MAdCAM-1等）和某些炎症相关酶类（iNOS、COX-2），这些细胞因子引起急性炎症反应，启动适应性免疫过程，促进细菌的清除并且维持正常的肠道稳态。因此，在肠道炎症，早期信号分子或者固有细胞因子的表达下降会导致细菌清除不彻底，进而导致慢性炎症；而在肠道炎症晚期，NOD2下游信号通路的过度激活会导致信号通路的持续刺激和促炎症因子的过量释放，同样会导致持续的慢性肠道炎症^[10]。

        大量的研究表明，16号染色体上的NOD2基因变异是与CD发病相关最密切的基因改变^[10]。该基因变异会导致NOD2羧基端的LRR切断^[10]，NOD2下游信号通路无法激活。NOD2下游信号通路的失活与CD发病的具体关系还有待进一步验证^[10]。根据目前的研究结果推测，NOD2下游信号通路的紊乱甚至功能丧失会导致细胞因子表达减少，对肠道细菌的清除减少，而且与肠道黏膜免疫系统的相互作用也减少，肠道细菌的持续存在，就会导致慢性炎症的发生。这可能与正常的固有免疫应答的缺陷会导致代偿性的适应性免疫应答的激活有关^[11]，固有免疫缺陷时，适应性免疫会被招募，这可能会导致不合适的炎症反应，这种理论目前还有待验证^[12]。

        有些CD病人NOD2基因没有变异^[10]，但是他们的NOD2信号通路也有未知的功能缺陷，也会有类似的发病机制。

NOD2在肠道的自主防御中起着关键作用，NOD2缺陷的小鼠对胃肠道内环境的改变高度敏感，并且潘氏细胞分泌的α防御素也减少^[1]。而且最近的研究表明，NOD2缺陷的小鼠肠道共生菌的组成和数量都发生了改变。另外，Petnicki Ocwieja等发现在NOD2缺陷的小鼠中，回肠末端寄生菌的数量增加，隐窝分泌的抗菌活性物质减少^[1]。在化学诱导和抗原诱导的肠炎模型中，与野生型小鼠相比，NOD2缺陷的小鼠对炎症的敏感性大大提高，肠道中发现有过度反应的炎症^[11]。而且，在野生型小鼠中，用NOD2的配体进行治疗可以改善炎症的症状^[11]。这些都证明了NOD2信号通路在CD发病中的重要作用。

NOD2除了在固有免疫的信号通路中发挥重要作用外，还可通过诱导自体吞噬对进入细胞的细菌进行处理。

自体吞噬作用

        自体吞噬是一种调节细胞内稳态的调节机制，细胞器和细胞内的入侵分子被包裹在自噬性溶酶体中，最终运送到溶酶体，通过这个过程细胞实现分子的循环利用，在固有免疫和适应性免疫中都发挥着重要作用。ATG16L1（Autophagy-related protein 16like-1）是自体吞噬作用中起重要作用的蛋白质。近来有研究表明，ATG16L1基因变异导致的自体吞噬作用的缺陷与CD的发病有关^[13]。

        ATG16L1与固有免疫过程有着紧密的联系，NOD1和NOD2都可以指导ATG16L1趋于质膜上的细菌入侵位点从而启动自体吞噬过程来清除入侵的致病菌^[14]。研究表明，NOD2的配体可以诱导自体吞噬的启动^[12]。当NOD2基因发生与CD相关的变异时，NOD2与ATG16L1的联系会被抑制，这会导致自体吞噬过程的减弱，巨噬细胞分泌细胞因子减少。而在携带有ATG16L1变异基因的人类细胞中，即使用MDP处理，它的自体吞噬过程也会减弱。这表明NOD2和ATG16L1在自体吞噬过程中都是必不可少的^[12]。

上皮渗透性

        调查发现，CD患者及他们的一级亲属肠道黏膜的渗透性都提高，所以有人提出假设上皮渗透性的提高可能是炎症性肠病的始发因素^[15]。最近研究发现，上皮通透性的提高还与CD患者复发有关^[16]。也有研究发现CD患者的配偶肠道黏膜上皮的通透性也提高^[17]，所以到底上皮通透性的提高是疾病的首发因素还是环境因素的影响还要进一步验证。

内质网应激

        内质网是细胞内负责蛋白质的合成、折叠和装配的细胞器，细胞的蛋白质负荷与内质网处理蛋白质的能力之间的失衡称为内质网应激（ER-stress），而与之相关的应答称为非折叠蛋白应答（Unfloded Protein Response, UPR）^[18]。现已知有三种跨膜蛋白可以引起UPR，分别是inositol-requiring enzyme 1（IRE1）、protein kinase-like ER kinase （PERK）和activating transcription factor 6（ATF6）。X-box-binding protein1（XBP1）是IRE1通路的重要调节因子，它可被内质网中大量堆积的未折叠的或错误折叠的蛋白质所激活^[19]。UPR激活初期，可通过停止蛋白质翻译、降解错误折叠的蛋白以及激活促进蛋白伴侣生成的信号通路来恢复正常的细胞功能，如果无法恢复或者失衡持续存在，UPR就会指导细胞进行凋亡。

        近来有研究表明，XBP1基因变异与UC和CD的发病有关，XBP1缺陷的小鼠会发生内质网应激和自发的小肠炎^[20]。具体的机制尚不明确，目前有如下的假说，上皮细胞中XBP1缺陷会导致IRE1的高表达，UPE过度激活，潘氏细胞和杯状细胞减少，黏液层和抗菌肽形成障碍，肠道黏膜屏障保护作用下降，肠道细菌能够穿过黏液层粘附到上皮细胞上，诱发过度的适应性免疫过程，最终形成慢性炎症。

肠黏膜屏障功能的检测

肠通透性检测

        静脉或者口服给予示踪剂，一段时间后检测尿液中的示踪剂的量，对比之下可以得知示踪剂通过肠道上皮细胞的剂量，即反映了肠黏膜的通透性。目前用于检测肠道黏膜通透性的示踪剂主要有放射性同位素类、糖类及聚乙二醇^[21]。它们穿过肠黏膜的机制尚不十分清楚，可能有两种途径，即跨细胞途径和细胞旁途径。直径较大的示踪剂如乳果糖、纤维二糖等可能由细胞旁途径通过肠黏膜，而直径较小的示踪剂如甘露醇、鼠李糖等可能由跨细胞途径通过肠黏膜。理想的示踪剂应具备以下特性：在肠道中以简单扩散的方式被肠道上皮吸收，不参与机体代谢反应，无毒性，无免疫原性，以原形100%从尿中排泄，可以用简单的方法检测。综合各方面考虑，目前广泛应用于临床的是糖类。

        具体操作方法如下：测试前晚10：00 起禁食，测试当天早晨8：00 排空小便后，口服50 ml 测试液（内含乳果糖10.0g和甘露醇5. 0 g）。收集口服测试液后6 小时内的全部尿液并记录尿液总量。摇匀后取其中10 ml处理后保存待检。然后算出标本中甘露醇及乳果糖浓度，并计算乳果糖和甘露醇的回收率、排泄率及其比值（L／M）^[21]。

        当肠黏膜屏障功能受损时，肠黏膜萎缩，细胞间连接受损，导致细胞间隙增大，经细胞旁途径的乳果糖的吸收增加；而经跨细胞途径的甘露醇的吸收变化不大，所以二者排泄率的比值（L /M）变大^[21]。而且，同时检测两种糖类可以排除胃肠蠕动、肾排空等因素的影响，更好地反映肠黏膜通透性的改变。

肠黏膜形态学检查

        肠黏膜形态学检查即通过肠镜直接观察肠道黏膜上皮细胞形态改变、隐窝深度、黏液层厚度等，该检查可直接反映肠黏膜通透性的改变。如果有上皮细胞的萎缩则说明肠道上皮的通透性可能提高，隐窝变深或者黏液层变薄可能说明粘蛋白和抗菌肽的分泌减少。近年来出现的透射电镜或扫描电镜可以观察肠道黏膜上皮细胞的超微结构改变如细胞间连接等，细胞间连接的改变可以直接反应肠道黏膜屏障的完整性^[2]。

病原学实验

        实验发现，肠道细菌的易位是以革兰阴性菌为主，最常见的是大肠杆菌^[22]。如在外周血中检测到大肠杆菌则说明肠屏障功能发生障碍。目前常用的检测标本是患者血液，通过实时定量PCR(RQ-PCR)方法定量检测患者外周血中大肠杆菌的DNA，可以很好地判断患者肠道细菌的易位情况，对肠道屏障功能做出估计。

小结

        炎症性肠病是小肠黏膜屏障免疫失调的结果，多种因素在小肠黏膜屏障的免疫应答平衡中发挥作用。目前越来越多的研究关注于敲除或屏蔽某一个因素的影响，得出的结论往往无法让人满意。今后的研究需要参与疾病的各个因素之前的相互作用，以进一步明确炎症性肠病的具体发病机制，进而找到有效的诊断和治疗方法。

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