摘要 目的 观察肠道细菌在炎症性肠病( inflammatory bowel disease，IBD)患者和健康者中的表达差异，分析肠道细菌感染与炎症性肠病的关系 方法 收集经过内镜检查及病理报告确诊的 100 例克罗恩病( Crohn's disease，CD)患者， 80 例溃疡性结肠炎( ulcerative colitis，UC)和 80 例健康者的粪便及血清样本，PCＲ 法和酶联免疫吸附试验对难辨梭状芽孢杆菌( Cd) 沙门氏菌( Sm)和金黄色葡萄球菌( Sa)的表达进行检测 结果 IBD 患者中 Cd Sm 和 Sa 的感染率分别为 10． 6% 8． 3% 和 7． 8%， 显著高于健康组( P =0． 003， 0． 018， 0． 023) ;活动期 CD 和 UC 患者 Cd Sm 和 Sa 的感染率均显著高于缓解期患者( P = 0． 008，0． 022;P = 0． 025， 0． 011;P = 0． 025， 0． 021 )， CD 和 UC 患者的细菌感染率差异无统计学意义( P ＞ 0． 05 )IBD 患者病变部位包含结肠 使用激素及免疫制剂治疗， 与上述 3 种细菌的感染有显著关联( P ＜ 0． 05 )， 而吸烟史及使用美沙拉嗪治疗与细菌感染无显著关联( P ＞ 0． 05 ) 结论 本研究结果提示肠道细菌感染与炎症性肠病关系密切。
　　炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)包括克罗恩病(Crohn's disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)， 其主要临床表现为黏液脓血便 腹痛 大便次数增多和体质量的下降等［1］IBD 的发病机制目前尚不明确， 诱发 IBD 的四大要素为基因异常 免疫调节紊乱 肠屏障功能受损和肠道菌群改变［2］ 研究表明， 多种细菌在该疾病发生及进展中发挥重要作用， 如难辨梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile，Cd) 沙门氏菌( salmonella，Sm) 和金黄色葡萄球菌 ( staphylococcus aureus，Sa)［3-5］， 能通过黏附于肠黏膜上皮细胞对其进行破坏， 并诱导疾病复发［6］ 本研究通过观察上述 3 种细菌在 IBD 患者和健康者中的表达差异， 分析肠道细菌感染与炎症性肠病的关系
1 资料与方法
1． 1 一般资料
　　收集2012 年6 月至 2013 年 11 月在同济大学附属第十人民医院消化内科确诊的 IBD 患者 180例及80 例健康者， 诊断标准参照中国炎症性肠病诊疗共识意见［7］ 病例排除标准: (1) 病程短于3 个月;(2) 4 周内使用头孢类 甲硝唑 青霉素和万古霉素抗生素;(3) 正进行灌肠及肠道准备者 详细记录每位 IBD 患者的年龄 性别 疾病分型 内镜检查 治疗方法和吸烟史等临床资料。
1． 2 酶联免疫吸附试验
　　抽取空腹患者和健康者的静脉血液 2 ml， 简单离心后收集血清并立即储存于 80 ℃冰箱中直至使用 血清样本进行 Cd Sm Sa 的双抗体夹心 ELISA检测(购自美国 ＲD 公司)， 每块96 孔板上设置阴性对照2 孔， 阳性对照 2 孔， 空白对照 1 孔， 样品采用复孔检测， 最后使用 BioTek Synergy2 仪器于450 nm波长处读取空白孔调零后的各孔吸光度值(D450 )
　　试验有效性判定: 阳性对照孔平均值 1． 00， 阴性对照孔 0． 10 临界值阴性对照孔 0． 15， 样品 D450
临界值为细菌感染阳性
1． 3  PCＲ 试验
　　使用无菌 EP 管收集患者和健康者清晨第 1次排便时的粪便约 1 g (或 1 ml)， 30 min 内储存于 80 ℃冰箱中， 并于 24 h 内使用粪便 DNA 提取试剂盒进行提取(购自中国天根公司)， DNA 的D260 /D280比值均在 1． 7 ～ 1． 9 范围内 标准菌株购自国家菌种保藏中心， 细菌引物由上海生工公司合成， 使用 TaKaＲa 公司 SYBＲ Premix EX Taq试剂盒对 DNA 样品和标准菌株 DNA 进行扩增检测。
　　难辨梭状芽孢杆菌毒素 A(158 bp)上游引物:5'-TCTACCACTGAAGCATTAC-3';下 游 引 物: 5'-TAGGTAC-TGTAGGTTTATTG-3' 沙门氏菌 stn 基因( 260 bp ) 上 游 引 物: 5'-CTTTGGTCGTAAAA-TAAGGCG-3';下游引物:5'-TGCCCAAAGCAGAG-AGATTCTG-3' 金黄色葡萄球菌 femB 基因(93 bp)上游引物: 5'-AATTAACGAAATGGGCAGAAACA-3';下游引物: 5'-TGCGCAACACCCTGAACTT-3'。
1． 4 病例分组
　　本实验包括 100 例 CD 和 80 例 UC， 其中 52例活动期 CD( A-CD)、 48 例缓解期 CD( Ｒ-CD)、41 例活动期 UC ( A-UC )、 39 例缓解期 UC ( Ｒ-UC)， 通过克罗恩病疾病活动指数(Crohn's disease activity index，CDAI)、 克罗恩病内镜下评分( the simple endoscopic score for Crohn's disease，SES-CD)和 Mayo 指数分别对 CD 和 UC 的病情严重程度进行评分， 活动期 CD 患者 CDAI 评分超过150，活动期 UC 患者 Mayo 指数超过 3［8］。 ELISA 和PCＲ 方法同时能够检测出时， 可判定存在细菌感染。
1． 5 统计学处理
　　所有数据均使用 SPSS 17． 0 统计软件进行分析。 应用 ANOVA 分析各组间 D 值差异，χ2
　　检验用来评价细菌感染阳性和阴性两组间各项指标是否存在差异， 数值以ˉx ± s 表示， P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2 结 果
2． 1 一般情况分析
　　在参与此次研究的 180 例 IBD 患者中， 平均年龄(38． 85 ± 17． 06)岁， 男女比例 1． 2 ∶ 1， 平均病程(4． 58 ± 2． 15)年 在 80 例健康者中， 平均年龄(28． 52 ± 9． 08)岁， 男女比例1∶ 1
2． 2 各组难辨梭状芽孢杆菌感染情况分析
IBD 患者 Cd 感染率为 10． 6% (19 /180)， 显著高于健康组， 差异有统计学意义(P = 0． 003)， 其中活动期 CD 患者 Cd 感染率 17． 3% (9 /52)， 活动期UC 患者 Cd 感染率21． 9%(9 /41)， 见表1。 处于活动期 CD 或 UC 患者 Cd 感染率显著高于缓解期患者(P = 0． 008， 0． 022)， 而CD 组与UC 组Cd 感染率差异无统计学意义(P = 0. 448)。 使用 ANOVA 分析可见， 活动期 CD 患者 OD 值显著高于缓解期 CD患者(P = 0． 024)， 而活动期 UC 患者 OD 值与缓解期 UC 患者差异无统计学意义(P = 0． 062)。
 

2． 3 各组沙门氏菌感染情况分析
　　IBD 患者沙门菌感染率为 8． 3% (15 /180)， 显著高于健康组， 差异有统计学意义(P = 0． 018)， 其中活动期 CD 患者感染率为 13． 5% (7 /52)， 活动期UC 患者感染率为19． 5% (8 /41)， 见表 2， 处于活动期 CD 或 UC 患者沙门菌感染率显著高于缓解期患者(P = 0． 025，0． 011)， 而 CD 组与 UC 组感染率差异无统计学意义(P = 0. 469)。 使用 ANOVA 分析可见， 活动期CD 和UC 患者D450值均显著高于缓解期患者(P = 0． 015，0. 01)。

2． 4 各组金黄色葡萄球菌感染情况分析
　　IBD 患者金黄色葡萄球菌感染率为 7． 8% (14 /180)， 显著高于健康组， 差异有统计学意义( P =0. 023)， 其中活动期 CD 患者感染率为 13． 5% (7 /52)， 活动期 UC 患者感染率为17． 1% (7 /41)， 见表3， 处于活动期 CD 或 UC 患者金葡菌感染率显著高于缓解期患者(P = 0. 025，0． 021)， 而 CD 组与 UC组的感染率差异无统计学意义(P = 0． 663)。 使用ANOVA 分析可见， 活动期 CD 和 UC 患者 OD 值均显著高于缓解期患者(P = 0． 000，0． 005)。
2． 5 临床特征与细菌感染关系
　　在发生 Cd Sm 和 Sa 感染的各 19、 15 和 14 例IBD 患者中， 分别有 84． 2% (16 /19)、 86． 7% (13 /15)和85． 7%(12 /14)的患者的病变部位包含结肠，有84． 2% (16 /19)、 80． 0% (12 /15)和 92． 9% (13 /14)的患者使用激素治疗， 有 78． 9% ( 15 /19 )、93. 3%(14 /15)和 92． 9% (13 /14)的患者使用美沙拉嗪治疗， 有 100% ( 19 /19 ) 86． 7% ( 13 /15 ) 和92. 9% (13 /14 ) 的患者使用免疫抑制剂治疗， 有31. 6%(6 /19) 40． 0% (6 /15)和 42． 9% (6 /14)的患者有吸烟史 而在相应未发生 Cd Sm 和 Sa 感染的 IBD 患者中， 分别有 57． 1% (92 /161 ) 55． 8%(92 /165)和54． 2% (90 /166)的患者的病变部位包含结肠， 有 37． 3% (60 /161) 36． 4% (60 /165 ) 和37． 3% (62 /166)的患者使用激素治疗， 有 80． 7%(130 /161) 90． 9% (150 /165)和 87． 3% (145 /166)的患者使用美沙拉嗪治疗， 有 18． 6% (30 /161 )24． 2%(40 /165)和 18． 1% (30 /166)的患者使用免疫抑制剂治疗， 有 24． 8% (40 /161 ) 33． 3% (55 /165)和30． 1% (50 /166)的患者有吸烟史 分析可得， 病变部位包含结肠或使用激素及免疫制剂治疗的 IBD 患者的 Cd Sm 和 Sa 的感染率明显增高， 组间差异有统计学意义(P ＜ 0． 05)， 而 IBD 患者的吸烟史及美沙拉嗪治疗与上述3 种细菌的感染无显著关联(P ＞ 0． 05)。
3 讨 论
　　正常人肠道大约有上亿个细菌， 重量约1 kg， 相当于一个正常成人的肝脏 肠道共生菌在人体免疫调节 营养吸收和解除毒素方面发挥着重要作用［9］。 高糖 高脂肪 高蛋白质及低纤维饮食会逐渐破坏肠道菌群的稳态［10］。 肠道细菌稳态的失衡不仅能够诱发肠道发生炎症损伤， 而且肠道菌群与肠道黏膜之间反应通路异常会导致肠道肿瘤发生［11］。 随着饮食及生活习惯与西方国家逐渐相近，近年来 IBD 在我国的发生率逐年升高， 虽然肠道细菌组成的多样性已被报道［12］， 但有关我国 IBD 患者肠道细菌感染的研究仍较少 梭状芽孢杆菌是一种阳性厌氧致病菌， 其感染率在 IBD 患者中高， 不利于疾病的缓解与愈合［13］。 沙门菌通过转运肠滤泡上皮细胞进入扁平细胞， 使肠道黏膜抵抗侵袭能力下降［14］。 金黄色葡萄球菌是一种机会致病菌， 能够黏附于人体肠道黏膜， 但某些乳酸细菌通过抗黏附和抗微生物作用对其进行替代［15］。 HLA B27 转基因小鼠在无菌环境中不发生结肠炎， 而灌肠注入普通拟杆菌等侵袭性细菌后， 小鼠发生轻度至中度的结肠炎［16］。 迄今为止， 只有10% ～ 40%的细菌能够进行人工培养基培育， 提高了鉴定肠道菌群种类的难度。
　　本研究结果显示， IBD 患者肠道细菌感染率高于健康者， 活动期患者高于缓解期患者 三种细菌中 Cd 感染率最高为10． 6%， 1 例 UC 患者同时感染三种细菌， 1 例 CD 患者和1 例 UC 患者同时感染沙门菌与金葡菌， 2 例 UC 患者同时感染 Cd 与沙门菌。 病变部位包含结肠或使用激素及免疫制剂治疗的 IBD 患者的感染率明显增高， 组间差异有统计学。意义(P ＜ 0． 05)， 而 IBD 患者的吸烟史及美沙拉嗪治疗与上述 3 种细菌的感染无显著关联( P ＞0. 05) 虽然细菌感染率在 IBD 患者中较低， 但细菌及毒性产物对疾病的发生和发展起着关键作用，检测肠道细菌感染能帮助临床医师更好地评估患者病情。
　　由于本次研究中样本量较少， 只针对 3 种细菌进行检测， 无法排除其他细菌在炎症性肠病中的重要作用。 IBD 中肠道菌群的多样性尚需大样本研究， 细菌感染机制及合并细菌感染的 IBD 患者的相关临床治疗需要深入探讨。
邱骅婧，刘占举