单抗英夫利西对克罗恩病人T细胞亚群及相关细胞因子的影响
王红 李呈贞 钮晓音 王正廷 范嵘 席晔斌 赵晴 程文婧 钟捷 陈广洁

克罗恩病 Crohn’s disease CD 是一种慢性?复发性?原因不明的胃肠道慢性炎性肉芽肿性疾病? 病变可发生于消化道的任何部位, 呈节段性或跳跃式分布, 但以末段回肠和右半结肠最多见?CD临床表现复杂 常以腹痛? 腹泻? 腹? 瘘管形成和肠梗阻为特点 可伴有发热? 贫血? 营养障碍以及关节? 皮肤? 眼? 口腔黏膜? 肝脏等肠外损害? 现全球发病率逐年上升 但由于发病原因未明, 在治疗方面仍缺乏根治性手段?
英夫利西单抗 Infliximab IFX 是一种直接针对TNF - α的嵌合性单克隆抗体 已经用于治疗CD? 本文就IFX治疗CD前后患者的 T细胞亚群细胞数量变化? 外周血相关促炎细胞因子水平及转录因子的表达变化进行测定, 初步探讨其免疫调节作用?
1 材料与方法
1.1  临床资料 11例CD患者 来自2011年6月至2012年12月期间上海交通大学医学院 属瑞金医院消化内科, 主要依据典型的临床表现? 结肠镜检查及病理学检查而确诊 CD的诊断标准参照中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组制定的《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》?CD的疗效按《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》的克罗恩病活动性指数 CDAI 评价:<150为临床缓解期; 150~219为轻度活动期;220~450为中度活动期;>450为重度活动期?
1.2  IFX治疗计划 IFX已成为治疗CD的常规用药, 所有患者均被知情告知? 具体治疗方法是患者第0周? 2周? 6周? 14周分别接受IFX静脉注射作为诱导缓解治疗, 其后第22周静脉注射一次作为维持缓解治疗, 共治疗22周? 我们采用下阶梯治疗方法, 即对初次确诊为CD的活动性患者, 未进行其他药物治疗, 直接进行IFX治疗?
1.3 主要试剂 anti - CD4 - PerCPC y 5.5? anti -IFN - - APC? anti - IL - 17 – PE? anti - CD25 - PE和anti - Fox p 3 – FITC, 美国 eBioscience 公司; PMA?Ionomycin? Golgiplug, 美国Sigma公司产品 Fi-coll淋巴细胞分离液, 上海国药集团化学试剂有限公司产品; Trizol试剂, 美国Invitro g en公司产品; 逆转录试剂盒, QIAGEN 公司产品; SYBR –Green master mix, 美国 ABI公司; 人细胞因子IFN – γ?IL – 17? TGF – β?IL - 6 和 OPN 的 ELISA Kit ,美国R&D公司?
1.4 流式细胞分析 取静脉血 肝素抗凝 用密度梯度离心法得到单个核细胞( PBMC )悬液 经PBS洗涤后, 重悬细胞, 加入细胞表面标志抗体, 4℃避光孵育30 min; 用含2% FBS的PBS
洗去游离的抗体? 4℃破膜1h后, 破膜洗液重悬细胞， 加入胞内标志抗体染色。染色前先用PMA、 Ionomycin、 Golgiplug刺激5h。 测定Th1/Th17亚群( anti - CD 4- PerCP/Cy 5.5、 anti - IFN -γ –APC、 anti - IL - 17 – PE)， Tre g亚群（ anti - CD4 - Per –CP/Cy 5.5、 anti - CD25 - PE 和 anti - Fox p 3 - FITC）4℃避光孵育30min。 用破膜洗液洗去游离抗体后， 用2%多聚甲醛固定细胞， 混匀后流式细胞仪检测。
1.5 细胞因子检测 治疗前后 CD患者均检测血浆IFN – γ、IL - 17 、TGF – β、IL - 6和 OPN水平。 取抗凝静脉血分离血浆保存待检。 按照ELISA Kit操作说明检测相应的细胞因子。 方法简述如下： 酶标板预先包被抗体， 室温过夜； 洗板4次； 加入封闭液室温孵育1h； 洗板； 加入待测样本100 μl，室温孵育2h； 洗板4次； 加入生物素标记检测抗体100 l 室温孵育1h； 洗板4次； 加入亲和素标记辣根过氧化物酶100 μl 室温孵育30min； 洗板4次； 加入底物TMB100 μl， 室温避光15min； 加入2mol/L H2SO4 终止反应； 450nm 波长检测吸光度（ A ）值。 所有标本均同批检测。
1.6  real - time - PCR检测 收集外周血标本， 分离PBMC， 按 照 常 规 方 法 用 Trizol 试剂提取总RNA， 然后用 Reveraid First Strand cDNA Syn-thesisKit逆转合成cDNA 以SYBRGreen master mix进行实时定量 PCR 从基因水平上检测 T –bet、 RORC、 Foxp3 的 mRNA 表达情况以GAPDH 基因为内参， 扩增条件如下： 50 ℃ 2min， 95℃10min， 95℃15s， 60℃60s， 共40个循环。
PCR引物序列为
Human T- bet（F） GCCTGGACCCAACTGT-CAAT，
Human T- bet（R） TGGCCTCGGTAGTAG-GACAT；
Human RORC（F） AGAAGACCCACACCT-CACAAA，
Human RORC（R） ACCACGTACTGAATG-GCCTC；
Human Foxp3（F） GTGGCCCGGATGT-GAGAA，
Human Foxp3（R） GGAGCCCTTGTCGGAT –GATG；
Human GAPDH（F） CGAGATCCCTC –CAAAATCAA，
Human GAPDH（R） AGGTCAGGTCCAC –CACTGAC。
1.7 统计学分析 用GraphPad Prism 5进行成组t检验。*P＜ 0.05 表示具有显著统计学意义，**P＜ 0.01 表示具有非常显著统计学意义。
2 结果
2.1  IFX治疗CD的临床疗效评价 11例CD患者经IFX 的治疗后病情均有明显好转 治疗前的CDAI评分为191.55±45.54， 治疗22周后 CD患者的 CDAI评分下降为66.82±40.32， 治疗后与治疗前相比， CDAI评分差异显著（ P ＜0.01）。提示IFX对于CD有明显诱导缓解作用。
2.2 IFX治疗对CD患者Th1、 Th17和Tre g细胞
的影响 Th1和Th17是分泌IFN-γ 和IL - 17的主要细胞群， 因此在治疗过程中我们监测了外周血中Th1和Th17亚群的变化情况， FACS检测结果表明Th1和Th17的CD4+T细胞的比例， 随着治疗的进行， 明显下降。 Tre g细胞的 CD4+ T 细胞的比例则明显增加。（ 图1）
 图1）

2.3 IFX治疗对CD患者细胞因子分泌的影响 我们研究观察了IFX对CD治疗前后患者血浆中细胞因子IFN-γ 和IL - 17水平的变化情况。 如图2所示， 治疗后CD患者外周血中的IFN- γ和IL - 17表达均较治疗前有下降趋势， 并随着治疗时间的推移， 下降程度更为明显， 呈现持续改善的状态， 治疗22周后与治疗前相比， 差异显著 （P＜ 0.05）。提示随着IFX作用时间的增加， 对IFN -γ 和IL - 17的抑制程度更加明显。 同时 OPN的检测结果显示治疗后CD患者的OPN水平下降 治疗后14周时与治疗前相比显著差异（ P＜ 0.05 ）。另外我们还检测了IL - 6和TGF -β 的分泌水平 结果显示两种细胞因子治疗后较治疗前无明显差异 。（图2）



2.4  IFX治疗对CD患者T细胞亚群相关转录因子的影响 为了进一步观察IFX治疗对 T细胞分化过程中关键转录因子的影响 我们用 real – time PCR方法分析了上述细胞相关的转录因子 mRNA表达水平 如图3所示 治疗后 T- bet、 RORC均降低 尤以22周最为明显（ P ＜0.05 ）。Treg转录因子则在第6周即有显著升高（ P＜ 0.01 ），此后逐渐下降， 但在14周和22周时与0周时相比仍有显著差异 （P＜ 0.05）。
3 讨论
肠道免疫平衡是由调节性 T 细胞 regulatory T cell Treg 和效应性 T细胞调控维持。 效应性T细胞可以分为辅助性T细胞 helper T cell Th）和细胞毒性 T 细胞。 Th在不同细胞因子的刺激下， 可以分化为 Th1、 Th2及 Th17亚群。 Th1主要介导细胞免疫， 产生IFN – γ，而 Th17主要通过分泌IL - 17等细胞因子介导炎症反应。
目前认为 CD 的发病是以 Th1介导为主，TNF - α是CD发病中一个重要的促炎细胞因子。TNF - α在CD中的致病方式主要是以一种旁分泌和自分泌的形式在局部发挥作用， 使内皮细胞表面表达黏附分子， 然后使各种细胞如单核巨噬细胞、 淋巴细胞、 中性粒细胞等更容易聚集在炎症局部发生活化， 进一步分泌 TNF - α及其他促炎细胞因子，刺激各种炎症介质的产生， 从而增强、 放大炎症连锁反应， 最终导致一系列组织损伤和坏死。 也有研究提示， CD的发病是由IL - 23依赖的 Th17细胞或其他分泌IL - 17的淋巴细胞引起的， 胞外细菌侵入肠道黏膜引起IL - 23的表达， 使 Th17细胞释放IL - 17A、 IL - 17F等细胞因子， 这些细胞因子反过来对肠道上皮细胞、 巨噬细胞等发挥促炎效应。
IFX是一种合成的人- 鼠嵌合 （75%人源性，25%鼠源性） 抗 TNF - α的Ig G1 型单克隆抗体。IFX可通过与巨噬细胞和T细胞表面表达的 TNF - α高亲和力结合， 随后通过抗体依赖性细胞毒作用、 补体依赖性细胞毒作用， 使表达 TNF - α的细胞发生凋亡， 其也可直接拮抗TNF - 的生物活性。临床研究表明IFX 对于 CD 有明显诱导缓解作用。 我们的临床研究显示CD患者接受IFX治疗后CDAI评分从191.55±45.54下降到66.82±40.32， 有显著临床改善。
有研究表明 CD 患者淋巴细胞高表达 Th1类细胞因子IFN – γ。而IFN - γ主要由 Th1细胞分泌， 而IL - 17主要由 Th17细胞分泌， 因而检测分泌这两种细胞因子的CD4+T细胞比例， 可间接反映细胞亚群的比例变化。 我们首先观察了IFX对外周血T细胞亚群的影响。 研究发现IFX治疗后CD4+T细胞分泌的IFN - γ和IL - 17细胞因子水平显著下降， 结果提示IFX治疗能通过下调 Th1和Th17细胞亚群的比例， 来降低促炎细胞因子的水平， 从而缓解肠道局部炎症。 其次研究发现，Treg比例较治疗前有显著升高， 说明患者体内Treg因发挥抗炎作用而反馈性增加。
细胞因子在炎症的发生、 发展和转归中起着极其重要的作用。 在炎症应答中， 巨噬细胞是细胞因子的主要来源。 释放促炎细胞因子如 TNF –α、IL – 6、 骨桥蛋白（ osteopontin， OPN ）等。 IFN-γ、IL – 17、 IL - 6和 TNF - α细胞因子间具有协同和网络作用， 促成炎症的发生和发展， 特别是IFN-γ可活化 MΦ 细胞的作用， 进而 MΦ 细胞产生的细胞因子IL – 1、 IL - 6和TNF更进一步增强了炎症反应。 OPN是一种Th1型促炎细胞因子， 可由多种组织和细胞产生并具有多效性。 OPN 介导细胞的粘附、 迁移等多种细胞行为， OPN 的表达与巨噬细胞的趋化相关， 在调节巨噬细胞浸润中起关键作用。 我们检测了患者血清中 Th亚群相关促炎细胞因子水平。 在本研究中， IFX治疗后患者血清中IFN – γ、IL - 17和OPN的水平均较治疗前下降，进一步提示体内给予IFX治疗能减轻疾病的严重程度， 降低炎症水平。
研究发现CD4+T细胞亚群的分化由不同的细胞因子和转录因子调控。T- bet是 Th1亚群的特异性转录因子， 在 Th1细胞的分化发育中起着重要的作用； RORC是 Th17分化相关的主要转录因子； Foxp3是 Treg细胞特异性转录因子。为了进一步在 mRNA水平观察IFX治疗对T细胞分化过程中关键转录因子的影响， 我们通过real time PCR分析检测了上述细胞相关转录因子的 mRNA表达水平， 我们研究发现 IFX 治疗能降低 T –bet、 RORC， 升高Foxp3 mRNA 水平， 提示IFX能在转录水平调节 Th1和 Th17细胞亚群及 Treg细胞的分化， 从而控制炎症。
综上所述， 本研究发现IFX可通过影响转录因子水平而调节 CD4+ T 细胞亚群数量； 通过调节Th亚群相关细胞因子的水平， 降低促炎细胞因子的水平， 达到调节免疫平衡的作用。
现代免疫学 2013年第33卷第6期