STAT3基因多态性与中国汉族人群克罗恩病的相关性研究
                                        晨莉a， 王正廷b， 陈 明a， 张 吉a， 钟 捷b
（上海交通大学医学院附属瑞金医院a.特需医疗保健中心，b.消化内科，上海200025）

[摘要]目的：探讨 STAT3 基因 rs744166 及 rs2293152 位点多态性与我国汉族人群克罗恩病间的相关性。 方法：选取 232 例我国汉族克罗恩病患者（病例组）和 272 名汉族正常（对照组）作为观察对象，采用序列特异引物引导的 PCR 检测进行基因分型，分析病例组与对照组的基因型频率及等位基因频率。 结果：病例组与对照组中 2 个位点基的因型分布均符合 Hardy-Weinberg 平衡定律。 rs744166 位点的基因型频率及等位基因频率在病例组与对照组间的分布差异有统计学意义（P＜0.05），而 rs2293152 位点的基因频率及等位基因频率在病例组与对照组间的分布差异无统计学意义（P＞0.05）。 结论：STAT3 基因 rs744166 多态性与我国汉族人群克罗恩病易感性相关。
关键词：STAT3 基因； 多态性； 克罗恩病； 易感性

近 年 来 ， 炎 症 性 肠 病 （inflammatory bowel disease, IBD）在亚洲国家明显增多，但其确切的病因和发病机制目前尚未完全明了。 现知其发生与免疫功能异常有关，且遗传因素在其发生中起着重要作用。 近年来，随着分子生物学和生物信息学技术的不断发展和进步，从基因水平研究 IBD 的病因与发病机制，找寻其易感基因已成为当今科研工作者研究的热点之一。 从免疫反应相关基因入手，寻找IBD 的遗传易感基因也已成其遗传学研究的重要策略和学术切入点[1]。
信号转导和转录激活因子 （signal transducers and activators of transcriptions， STATs）属信号转导和转录活化因子家族成员， 是一类由细胞因子、生长因子等多肽类配体激活的转录因子[2]。 STATs 家族在哺乳动物中有 7 个成员, 包括 STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、sTAT5b、STAT6， 主要分布于淋巴细胞、巨噬细胞及树突状细胞中[2]。现知 STATs可通过蛋白酪氨酸激酶/信号转导和转录激活因子途径介导各种免疫反应, 包括参与天然免疫和适应性免疫调节及影响 T 细胞分化等[3-4]。 现已有一些基础 研 究 关 注 于 STATs 在 IBD 中 的 作 用 ， 以 对STAT3 的研究最多。 国外多个 IBD 遗传研究中心也相 继 开 展 多 项 了 STAT3 基 因 单 核 苷 酸 多 态 性（single nucleotide polymorphism, SNP） 与 IBD 的关联研究，而在我国未见相关报道。 克罗恩病（Crohn′s disease, CD）作为 IBD 中相对更为复杂也更为难治的一类疾病，其发病机制和免疫学研究也越来越多地引起人们的关注。 本研究拟对 STAT3 基因 SNP位点 rs744166、rs2293152 与我国汉族人群 CD 间的相关性进行分析。
资料与方法
一、资料
于 2010 年 10 月至 2012 年 6 月在上海交通大学医学院附属瑞金医院消化内科就诊或住院，且临床资料完整、 彼此无血缘关系的汉族 CD 患者共232 例纳入本研究（CD 组，包括新诊断及既往诊断者），其中男 149 例，女 83 例，平均年龄（34±14）岁，平均病程(5.42±4.82)年。另选择性别、年龄与病例组相匹配的 272 名同期在我院体检的我国汉族健康体检者作为对照组，其中男 172 例，女 100 例，平均年龄（36±12）岁。CD 组与对照组间的性别构成及年龄差异均无统计学意义，具有可比性。CD 的诊断标准参照中华医学会消化病学分会炎症性肠病协作组制定的《中国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见》[5]。 排除标准为，非汉族人口；经相关检查排除自身免疫性疾病、过敏性疾病、肿瘤病史等。 本研究经上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会批准，患者知情同意。 所有研究对象
均签署知情同意书。
二、研究方法
1. 基因组 DNA 提取： 采集 EDTA 抗凝静脉血2 mL， 使用临床样品基因组 DNA 小量抽提试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司) 提取白细胞基因组 DNA。 溶解于 TE 缓冲液中， 定量后置于-20 ℃下保存。
2. SNP 检测：STAT3 基因 rs744166 和rs2293152位点多态性采用序列特异引物-聚合 酶 链 反 应（polymerase chain reaction with sequence-specific primer， PCR-SSP）技术分析。 PCR 扩增反应体系为基因组 DNA 2 μL、上下游引物(10 μmol/L)各 0.15 μL（见表 1）、Taq 酶 0.1 μL、10×PCR 缓冲液 1.5 μL 和dNTPs 1 μL (2.5 mmol/L）, 加去离子水补至 15 μL。
PCR 步骤为， 先 95 ℃预变性 5 min, 再 95 ℃变性30 s, 退火（见表 1）30 s, 72 ℃延伸 45 s, 共进行 32个循环，最后 72 ℃ 5 min。 PCR 完成后，取 10 μL 的PCR 产物 ，上样缓冲液 （6×）2 μL，在 2％的琼脂糖凝胶中电泳，30 min 后， 在紫外线凝胶成像系统下观察。
3. PCR 产物序列分析：从 CD 组与对照组中随机各选取 20 个样本进行直接测序 (上海生工生物工程技术服务公司测序) , 结果表明 PCR-SSP 法与测序法鉴定的基因型的符合率达100%。
三、统计学处理
所有 SNPs 的遗传平衡应用 Hardy-Weinberg遗传平衡定律检测；2 组人群各位点基因型及等位基因的频率应用直接计数法，组间分布差异比较应用卡方检验，优势比（OR）评估相对危险度，计算95%可信区间(CI)。 以上统计均应用 SPSS 18.0 软件包，以 P＜0.05 为差异有统计学意义。
结 果
一、STAT3 基因 rs744166 扩增片段电泳结果
如图 1 所示， 通过 PCR-SSP 检测得到，CD 组中 CC 型 18 例，CT 型为 97 例，TT 型 106 例； 对照组中 CC 型 46 例，CT 型为 127 例，TT 型 98 例。 CD组中 11 例及对照组中 1 例无法确定基因型

二、STAT3 基因 rs2293152 基因扩增片段的电泳结果如图 2 所示， 经 PCR-SSP 检测确定，CD 组中CC 型 35 例，CG 型为 137 例，GG 型 58 例； 对照组中 CC 型 58 名，CG 型为 136 名，GG 型 78 名。 CD组中有 2 例无法确定基因型。
三、Hardy-Weinberg 平衡检验结果
CD 组与正常对照组 STAT3 基因 rs744166 和rs2293152 位点经 Hardy-Weinberg 平衡检验差异均无统计学意义(P>0.05)。 结果提示入选对象具有群体代表性，能够代表我国汉族人群总体基因型分布规律（见表 2）。
四、STAT3 基因 rs744166 C/T 多态性与我国汉族 CD 易感性的分析
STAT3 基因 rs744166 多态性位点的基因型和等位基因频率在 CD 组与对照组间的分布及比较见表 2。 结果显示，在 CD 组中，次要等位基因频率（minor allele frequency, MAF） 为 30.1% ， 而对照组中 MAF 为 40.4%， 对照组明显高于 CD 组 （χ2=11.28，P=0.000 8）。2 组的基因型频率差异亦有统计学意义（χ2=11.62，P=0.003）。 进一步分析证实，该位点 C 等位基因在 3 种遗传模式下均降低 CD 发病风险， 且有统计学意义 （加性遗传模型，OR=0.63;95%CI 为 0.48~0.83; P<0.001； 显性遗传模型，OR=0.61; 95%CI 为 0.43~0.88; P=0.008；隐性遗传模型，OR=0.43; 95%CI 为 0.24~0.77; P=0.005）

五、STAT3 基因 rs2293152 C/G 多态性与我国汉族 CD 易感性的分析
STAT3 基因 rs2293152 多态性位点的基因型及等位基因频率在 CD 组与对照组间的分布及比较见表 2。 结果显示，在 CD 组中 MAF 为 45.0%，而对照组中 MAF 为 46.3%，2 组间差异无统计学意义（χ2=0.18，P=0.67)。 2 组间的基因型分布差异亦无统计学意义 （χ2=5.16，P=0.08）（加性遗传模型 ，OR=0.94，95%CI 为 0.73～1.23，P=0.66； 显性遗传模型，OR=1.19；95%CI 为 0.88～1.77，P=0.39；隐性遗传模型，OR=0.66，95%CI 为 0.42～1.05，P=0.008）。 同样，对 3 种遗传模式的研究表明，该位点与 CD 的发病风险易感性无关（P>0.05）。

讨 论
现已有一些基础研究关注于 STATs 在免疫相关性疾病（包括 IBD）中的作用，其中以 STAT3 研究最多。 研究发现，STAT3 蛋白在适应性免疫细胞中的活化可诱导致病性 T 细胞生存寿命延长并引起免疫耐受紊乱[6]，而在天然免疫细胞中，STAT3 蛋白的活化参与维持及增强上皮细胞的屏障功能[7-8]。 各种细胞特异性基因敲除的 STAT3-/-小鼠肠炎模型研究亦提示，STAT3 在天然免疫系统细胞和适应性免疫细胞中扮演截然不同的角色，使其在 IBD 的发病中扮演独特的角色[7, 9-11]。
目前， 我国相关研究尚处起步阶段， 对于STATs 多态性与 IBD 发病的相关性研究较少。 作为国内较大的 IBD 基础与临床研究中心， 本研究对STAT3 的 rs744166 及 rs2293152 位点的分析结果表明，STAT3 基因 rs744166 位点的基因型及等位基因频率在 CD 组与对照组间存在统计学差异 （P<0.05）。1998 年，Barrett 等[12]开展的一项 CD 的全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS)发现，STAT3 基因的 rs7441166 位点与 CD 发病相关，其后新西兰的一项关联研究报道在 CD 患者中STAT3 rs744166 C 等位基因频率低于对照组 (OR=0.76, 95% CI 为 0.61~0.95, P=0.013)[13]。本研究的结果与前期研究结果相关， 证实 rs7441166 C 等位基因可降低 CD 发病风险。
在 本 研 究 中 ，CD 组 与 对 照 组 间 STAT3 rs2293152 位点的基因型及等位基因频率差异未达到统计学意义。 前期日本的一项研究发现，STAT3 rs2293152 位点的 C 等位基因和 CC 纯合子频率在CD 患者中明显高于对照组(P=0.007 及 P=0.001)[14]。2 项同为东亚人群的研究，结果不同可能与样本量的选择大小有关。 在本研究纳入 232 例 CD 患者和272 名正常对照者，而日本的研究仅纳入 83 例 CD患者和 200 名对照者。 当然，我们不排除该位点与其他人群 CD 具有相关性，也不排除该位点与其他的有功能多态性连锁的可能性。 开展多中心、不同人种的相关研究， 有助于进一步验证 STAT3 基因对 CD 发生的易感性及易感位点。
由于本研究病例数及地域较局限，故仍需行多中心大样本的队列研究，才能最终明确该基因多态性与我国汉族 CD 发病的相关性，为进一步筛选我国人群 IBD 的易感基因及未来发展基因诊断和治疗提供依据。