HＲM 技术检测炎症性肠病患者 TPMT 的基因多态性

                           徐 颖1，钱家鸣1，张 学2，赵秀丽2，吕 红1，刘彦山2，沈冰冰1

1． 中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院消化内科，北京 100730; 2． 中国医学科学院 北京协和医学院 基础医学研究院医学遗传学系
【摘要】 目的 应用 HＲM 技术检测炎症性肠病( IBD) 患者 TPMT 基因多态性，进而探索 IBD 患者 TPMT 基因型与硫唑嘌呤( AZA)致骨髓抑制的关系。方法 采用聚合酶链反应 － 高分辨熔解曲线( PCＲ-HＲM) 与 Sanger 法序列测定相结合的方法，对 82 例 IBD 患者和 53 名健康志愿者 TPMT 基因第 7、10 外显子进行检测。结果 IBD 患者中 TPMT* 1/* 3C 杂合子 4 例，健康对照者中 TPMT*1 /* 3C 杂合子 2 例。未检测出 TPMT* 3A 和 TPMT* 3B 型突变。IBD 患者 4 例出现骨髓抑制的患者中，1 例是 TPMT* 1 / * 3C 杂合子; 其余3 例为 TPMT 野生型。结论 TPMT* 3C( A719G) 基因突变在中国的 IBD 患者中较 TPMT* 3A( G460A/A719G) 、TPMT*3B( G460A) 发生率高，而存在此基因突变的 IBD 患者对硫唑嘌呤不能耐受，导致骨髓抑制。然而 TPMT 基因突变只能解释部分AZA 治疗 IBD 导致骨髓抑制的病例。
【关键词】 炎症性肠病; 甲基转移酶类; 基因型; 硫唑嘌呤

炎症性肠病( inflammatory bowel disease，IBD) 是一组病因未明的慢性肠道疾病。治疗该病的免疫抑制剂硫唑嘌呤( AZA) 和 6-巯基嘌呤( 6-MP) 在使用过程中某些患者出现严重的骨髓抑制而使治疗终止。硫唑嘌呤甲基转移酶( TPMT) 是 AZA 和 6-MP 代谢过程中的重要酶，它的低活性会导致 AZA( 6-MP) 的一种代谢产物 6-鸟嘌呤核苷酸( 6-TGN) 的浓度过高，而 6-TGN在体内浓度过高是引起骨髓抑制的主要原因［1-2］。
TPMT 酶活性在群体中存在明显的遗传变异性。TPMT 常见突变位点是位于第 7 外显子上的 G460A 和位于第 10 外显子上的 A719G，具有上述突变的患者TPMT 酶活性下降，因此在给予 AZA 治疗之前，如能查明患者是否携带有此突变，就可以指导 AZA 的治疗用量，进而预防这些患者骨髓抑制的发生［2-4］。本研究主要针对上述 2 个突变位点所形成的突变等位基因TPMT* 3A ( G460A / A719G) 、TPMT * 3B ( G460A) 、TPMT* 3C( A719G) 进行检测。目前，对于 TPMT 的基因型测定尚无金标准［5］，国内外对基因多态性的研究方法多采用 PCＲ-ＲFLP 和PCＲ-SSP，而本实验采用高分辨率熔解( high resolution melting，PCＲ-HＲM) 的方法，是近年来发展起来的新技术，本实验首次将其用于 IBD 易感基因的研究。
1 对象与方法
1． 1 一般资料 收集 2004 年 7 月 － 2008 年 6 月于北京协和医院( 71 例) 及上海第一人民医院( 11 例) 就诊的 IBD 患者共82 例。诊断均符合 2001 年成都全国炎症性肠病学术研讨会制定的标准。IBD 患者共 82 例( UC 38 例、CD 42 例、IC 2 例) ，其中男 50 例，女 32例，年龄 16 ～78 岁，平均年龄( 40． 48 ±13． 46) 岁。其中有 31 例患者使用了 AZA( 剂量 50 ～100 mg/d) 进行治疗。根据是否使用硫唑嘌呤治疗将 IBD 患者分为两组: 使用硫唑嘌呤治疗组( A 组) 和未使用硫唑嘌呤组( B 组) 。A 组中有 4 例患者出现了骨髓抑制。健康对照者53 名( C 组) ，为无血缘关系的无偿献血者和健康志愿者，其中男 28 名，女 25 名，年龄 23 ～ 73 岁，平均年龄( 41． 06 ±12． 72) 岁。A 组与 C 组、B 组与 C 组年龄差异无统计学意义( P ＞0． 05) ，具有可比性。
1． 2 方法
1． 2． 1 DNA 提取: 采集上述人群的外周血 4 ml，使用德国 Qiagen 公司生产的 DNA 提取试剂盒: QIAampDNA Blood Minikit 进行 DNA 提取1． 2． 2 第 7、10 外显子的 PCＲ 扩增: 采用巢式 PCＲ 的方法，所提取的 DNA 进行相应片段的扩增( PCＲ 引物见表 1) 。在内侧片段扩增的体系中加入 LCGreen 荧光染料( 美国 Idaho Technology Inc 公司生产) 。在TP600 仪( 日本 TAKAＲA BIO． Inc． 公司生产) 上完成PCＲ。第 7 外显子外侧体系反应条件为 95 ℃ 预变性 5min，然后进行 35 次循环( 94 ℃ 变性 20 s、60 ℃ 退火20 s、72 ℃ 延伸 20 s) ，最后在 72 ℃ 延伸 8 min，置 4 ℃保存。第 7 外显子内侧体系反应条件为 95 ℃预变性3 min，然后进行 35 次循环( 94 ℃ 变性 20 s、58 ℃ 退火20 s、72 ℃ 延伸 20 s) ，最后在 72 ℃ 延伸 5min，置 4 ℃保存。第10 外显子外侧体系反应条件为 95 ℃预变性3 min，然后进行 35 次循环( 94 ℃ 变性 35 s、58 ℃ 退火60 s、72 ℃ 延伸 60 s) ，最后在 72 ℃ 延伸 8 min，置 4 ℃保存。第10 外显子内侧体系反应条件为 95 ℃预变性3 min，然后进行 35 次循环( 94 ℃ 变性 20 s、60 ℃ 退火20 s、72 ℃ 延伸 20 s) ，最后在 72 ℃ 延伸 5 min，置 4 ℃保存。
1． 2． 3 基因检测: 使用 LightScanner Instrument 96( 美国 Idaho Technology Inc． 公司生产) 对第 7、10 外显子的 PCＲ 产物进行 HＲM 检测。取巢式 PCＲ 终产物 10μl 分别加入 96 孔检样板的加样孔中，将检样板放Light Scanner 中，调整好开始温度( start temp) 和终止温度( end temp) 后( 第 7 外显子和第 10 外显子的开始温度分别为 73 ℃ 及 72 ℃，终止温度分别为 88 ℃ 及84 ℃ ) ，仪器开始自动检样。
随机取经 PCＲ-HＲM 检测后认为是杂合型和野生型及其他未知型的样本各若干例，进行 PCＲ-测序( 由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成) ，以检测其真实的基因型是否与 PCＲ-HＲM 方法检测出的基因型相符。
1． 2． 3 基因检测: 使用 LightScanner Instrument 96( 美国 Idaho Technology Inc． 公司生产) 对第 7、10 外显子的 PCＲ 产物进行 HＲM 检测。取巢式 PCＲ 终产物 10μl 分别加入 96 孔检样板的加样孔中，将检样板放Light Scanner 中，调整好开始温度( start temp) 和终止温度( end temp) 后( 第 7 外显子和第 10 外显子的开始温度分别为 73 ℃ 及 72 ℃，终止温度分别为 88 ℃ 及84 ℃ ) ，仪器开始自动检样。
随机取经 PCＲ-HＲM 检测后认为是杂合型和野生型及其他未知型的样本各若干例，进行 PCＲ-测序( 由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成) ，以检测其真实的基因型是否与 PCＲ-HＲM 方法检测出的基因型相符。

1． 3 统计学方法 采用 SPSS 17． 0 统计软件分析数据。数据资料各组组间两两比较采用 t 检验。分类资料用率表示，采用卡方检验或 Fisher 确切概率法进行组间两两比较，P ＜0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 TMPT 基因突变检测 使用 PCＲ-HＲM 的方法检测了上述 IBD 患者及健康对照者共 135 份 DNA 样本，其第7 外显子溶解曲线及基因分型( 见图1，表2) 。为了求证由 HＲM 方法测定出的 DNA 样本的真实基因型，将上述样本中野生组和杂合组取部分样本进行测序，将未知型组的全部样本进行测序，测序结果见表 3。

综上，本研究在第7 外显子发现了3 例 TPMT* 1S( T474C) 纯合子，51 例 TPMT* 1S( T474C) 杂合子。在第 10 外显子发现了 6 例 TPMT* 3C( A719G) 杂合子，未发现 TPMT* 3C( A719G) 纯合子。
2． 2 TPMT 基因型的分布情况 未检出有 TPMT*3A 或 TPMT* 3B 突变。TPMT * 3C ( A719G) 在 IBD患者和健康对照者中共有 6 个杂合子被检出，IBD 患者和健康对照者之间 TPMT* 3C 突变率差异无统计学意义( P ＞0． 05，见表 6) 。

2． 3 TPMT* 3C ( A719G) 在 A 组患者中的分布情况 在使用过 AZA 的患者( A 组) 中，有 4 例发生骨髓抑制，但仅有 1 例为 TPMT* 3C 杂合突变，其余 3 例均为野生型，野生型和突变型患者发生的骨髓抑制率差异无统计学意义( P =0． 129) 。
3 讨论
PCＲ-HＲM 方法是近年来发展起来的新技术，HＲM 技术的优势在于: ( 1) 根据 PCＲ-HＲM 的原理，可以检测到所检测片段中可能存在的未知突变; 同样也可以针对已知突变点，设计非标记基因探针，对已知位点进行等位基因分型。( 2) PCＲ-HＲM 是一种大通量、快速、灵敏度高、不受检测位点局限的检测突变与基因型分析方法［7］。本研究首次将其用于IBD 易感基因的研究。研究结果提示，HＲM 检测出的基因型与最终的测序结果有着一定的差异。产生此差异的原因主要是 HＲM 技术对于需要检测的样本( 即 PCＲ 产物) 质量要求高，PCＲ 产物质量直接决定了测定结果的准确度，可能是该方法运用于临床的局限性。但基于其优点和本研究提示，PCＲ-HＲM 技术仍然有着广阔的应用前景。
本研究对 IBD 患者以及应用 AZA 的 IBD 患者的TPMT 酶进行了研究。TPMT 酶具有共显性遗传的特性。本研究结果提示，在第 7 外显子上检测出 T474C突变，这是一个同义突变，由于这个突变不会影响其蛋白质的合成( 异亮氨酸→异亮氨酸) ，故此突变不会影响 TPMT 酶的活性，被称为 TPMT* 1S。在第 10 外显子上无 TPMT* 3A 或 TPMT* 3B 被检出，但有 6 个TPMT* 3C ( A719G ) 杂合子被检出，占 4． 44% ( 6 /135) ，基因频率为 2． 22% ( 6 /270) 。而文献报道的亚洲人该基因频率在 0． 6% ～ 2． 54%［3，8-10］
，与本实验结果相符。IBD 患者的突变率并不显著高于健康对照者的突变率，差异无统计学意义( P ＞0． 05) 。本研究纳入了 31 例使用过 AZA 治疗的患者，其中有 4 例出现了骨髓抑制。在这 4 例骨髓抑制的患者中，只有 1 例是 TPMT* 3C/* 1 的杂合子。其他 3 例均为 TPMT* 1 基因野生型，且野生型和突变型患者在骨髓抑制发生率上差异无统计学意义。此结论提示，
仅凭 TPMT 基因检测作为骨髓毒性是否发生的依据是不够的。国外报道显示，TPMT 基因突变纯合型的患者在接受 AZA 常规剂量治疗时，几乎 100% 出现严重的骨髓抑制; 而杂合型患者发生严重骨髓抑制的可能性为 30% ～60%。除了受 TPMT 酶活性影响外，其他因素，如药物间的相互作用，也会引起患者出现骨髓抑制［11］。国内学者对汉族 IBD 患者进行研究后也认为，仅测定患者 TPMT 的基因型对预测骨髓抑制的发生是不全面的，而进行 TPMT 酶活性的检测有一定作用［12］。因此，对接受 AZA 或 6-MP 治疗的患者复查血常规非常重要。