miR-19a 对溃疡性结肠炎的作用机制

                                             周鹏志1，3，陈 斌2，胡品津1，孙 嫣3
                                      1中山大学附属第一医院消化科，广东 广州 510089；
                                      2广州中医药大学第一附属医院消化科，广东 广州510405；
                                      3广州医学院第三附属医院消化科，广东 广州 510150

摘要：目的 探讨miR-19a对溃疡性结肠炎的作用机制。方法 通过生物信息学分析预测miR-19a可能的靶基因，通过免疫组化及Western blotting技术检测靶基因在溃疡性结肠炎小鼠中表达的变化，并进一步通过绿色荧光蛋白报告载体实验对靶基因进行鉴定。结果 生物信息学分析预测miR-19a可能的靶基因是TNF-α，免疫组化及Western blotting显示溃疡性结肠炎小鼠肠道组织TNF-α表达增加，miR-19a可抑制TNF-α-3'UTR-WT报告基因活性，而变异型TNF-α-3'UTR-mut报告基因活性不能被抑制。结论 miR-19a的靶基因为TNF-α，其结合位点为TNF-α 3'UTR，miR-19a可能在肠道通过直接调控TNF-α而发挥作用。
关键词：溃疡性结肠炎；miR-19a；肿瘤坏死因子-α

溃疡性结肠炎（UC）的发病机制包括对肠道致病抗原损伤的免疫失调节导致肠道组织损伤，近年来的研究表明，miRNA参与了这样的免疫失调节过程［1-3］。我们的前期研究发现miR-19a在UC的动物模型及患者中的表达明显低于正常对照［4］，提示miR-19a在UC发病中可能为一个功能因子。本研究进一步进行生物信息学分析预测miR-19a靶基因及进行靶基因鉴定，以期更全面深入认识UC发生发展的分子机制，为UC的生物学防治提供新的分子靶标。
1 材料与方法
1.1 组织标本
小鼠结肠组织标本来源于本课题组造模蜡块［4］。
1.2 主要试剂
即用型二步法免疫组化检测试剂盒、DAB 酶底物显色试剂盒（广州永诺），小鼠抗人TNF-α单抗（Santacruz），小鼠抗人 Tubulin 抗体（Sigma），羊抗鼠二抗（Jackson lab），丙烯酰胺/二丙烯酰胺（Bio-Rad），彩虹分子量 Marker（Amersham Biosciences），HT29 细胞株（ATCC），RPMI-1640（Gibco），Lipofectamine 2000TM（Invitrogen），miRNA、UTR-WT、UTR-mu（t锐博生物），Dual-luciferase reporter assay system（Promega）。
1.3 实验方法
1.3.1 miR-19a 靶基因预测 通过在线比对，进行生物信息学预测miR-19a靶基因。
1.3.2 免疫组化法检测 UC 小鼠 TNF-α蛋白表达 即用型二步法试剂盒行抗TNF-α免疫组化，PBS代替一抗作为阴性对照。采用半定量积分法［7］计算免疫组化积分。
1.3.3 Western blotting 检测 UC 小鼠 TNF-α蛋白表达裂解液提取组织总蛋白进行电泳。小鼠抗人TNF-α单克隆抗体（1∶500）及小鼠抗人Tubulin抗体（1∶1000）克隆一抗抗体4 ℃过夜，二抗为辣根酶标记山羊抗小鼠IgG（1∶2000），ECL显色。以Image-pro plus 6.0软件进行灰度扫描分析蛋白表达的相对值。
1.3.4 miR-19a靶基因的鉴定
1.3.4.1 质粒构建 设计引物 F：5'-GGAGGACGAACATCCAACCT- 3' 及 R：5'-TAAGCAAACTTTATTTCTCG-3'，通过 PCR 将人源性 TNF-α（NM-000594）3'UTR区克隆出来，并通过酶切位点XbaⅠ插入PGL-3载体构建出UTR-WT，同时构建一个将与miR-19a匹配的7 bp区域去除的TNF-α3'UTR作为mutant对照（UTR-mut）。
1.3.4.2 转染并测定报道基因活性 培养大肠癌细胞株HT-29细胞，按照脂质体转染步骤，转染内参质粒、UTR-WT、UTR-mut或miR-19a。转染后的细胞用passive lysisbuffer（PLB）裂解离心。用 Dual- luciferase reporter assay system测定报道基因活性。
1.4 统计学处理
应用SPSS 13.0软件行统计分析，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，结果以均数±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 生物信息学预测miR-19a靶基因miR-19a靶基因进行进一步生物信息学预测，通过在线比对，软件分析显示miR-19a的靶基因为TNF-α（图1）。

2.2 DSS诱导的小鼠UC结肠TNF-α蛋白水平上调DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织分别进行免疫组织化学（IHC）及Western blotting检测TNF-α的表达水平。IHC时正常对照组织形态正常，TNF-α表达较弱，而UC时，小肠正常结构破坏，炎症细胞浸润，同时观察到TNF-α明显增强，与对照组相比，差异有显著性（P<0.05，图2）；C1、C2、C3为3例取自正常对照小鼠的样本，UC1、UC2、UC3为取自3例溃疡性结肠炎小鼠样本，Western blotting结果与IHC结果一致，正常对照组TNF-α呈弱表达，UC 组 TNF-α明显上调。以上结果表明：小鼠UC模型中，TNF-α激活并表达上调，与对照组相比，差异有显著性（P<0.05，图2）。

2.3   UC中miR-19a的靶基因的鉴定
为分析miR-19a是否直接作用于TNF-α，我们对miR-19a（小鼠和人源性）及TNF-α 3'UTR区（小鼠和人源性）进行分析；进一步将人源性TNF-α 3'UTR区克隆出来，插入PGL-3载体中（UTR-WT），同时构建一个将与miR-19a匹配的7 bp区域去除的TNF-α 3'UTR作为mutant 对照（UTR-mut），将质粒转染进人 HT-29 细胞，同时共转miR-19a，观察对报道基因活性的影响。结果发现，miR-19a可抑制UTR-WT活性，而将与miR-19a匹配的7 bp区域去除后，活性不能被抑制（P<0.05，图3）。

3 讨论
本课题组通过免疫疾病相关基因谱的前期筛查发现，miR-19a在小鼠DSS诱导的实验性结肠炎及UC患者肠粘膜中表达均明显下调，提示miR-19a可能是参与UC 发病的新的因子［4］。miR-19a最早由Ota等［5］克隆，位于 13q31.3，他们发现 5 个前体和 7 个成熟的microRNAs，其中 miR-19a 位于 C13ORF25 基因的 3'-UTR 区。Pezzolesi 等［6］首次发现miR-19a是一个生物学保守的miRNA。
miR-19a作为一种活跃的生物因子，被越来越多的学者证实其在多种疾病中发挥重要的作用。王坤等［7］通过荧光素酶实验证实SEPT7是miR-19a的直接靶点。此外，敲除SNBl9细胞miR-19a表达后，Westernblotting 检测转染 SEPT7 蛋白水平上调，RT-PCR 检测SEPT7 mRNA 无明显变化，提示 miR-19a 对 SEPT7 的调控在转录后水平。在体外血肿瘤屏障模型中证实，上调miR-19a在人脑微血管内皮细胞中的表达水平能显著增加血肿瘤屏障的通透性，同时伴有紧密连接相关蛋白ZO-l和occludin的表达下调［8］。除此之外，现已验证的miR-19a或miR-19b的直接靶点尚有失调症蛋白质1（ataxin- 1，ATXNl）、细胞因子信号传导抑制蛋白
（suppressor of cytokine signaling-1，SOCS-1）、细胞死亡调解子（Bcl- 2 interacting mediator of cell death，BIM）等［9-11］。
为了进一步探明miR-19a参与UC发病的机制，本研究首先通过生物信息学分析可知，miR-19a的靶基因为TNF-α，通过免疫组化和Western blotting均发现UC小鼠中TNF-α蛋白表达量明显高于对照组。小鼠和人源性的miR-19a及TNF-α 3'UTR均十分保守，预测结果为且miR-19a与TNF-α3'UTR区有一段相互匹配，存在miR-19a直接调控TNF-α直接调控的可能性。因此，我们采用人HT-29细胞系为模型，进一步对miR-19a的靶基因进行了鉴定，通过体外培养人结肠HT-29细胞株，我们将人源性TNF-α 3'UTR区克隆出来，插入PGL-3载体中（UTR-WT），同时构建一个将与miR-19a匹配的7 bp 区域去除的 TNF-α 3'UTR 作为 mutant 对照（UTR-mut），将质粒转染进人 HT-29 cells，同时共转 miR-19a观察对报道基因活性的影响，结果miR-19a可抑制UTR-WT 活性，而将与 miR-19a 匹配的 7 bp 区域去除后，活性不能被抑制。以上结果表明miR-19a可直接调控TNF-α，且结合位点为我们预测的保守区域。我们认为TNF-α的3'-UTR区可能是UC小鼠miR-19a的潜在作用靶点。已有研究在食管癌中证实TNF-α是miR-19a的作用靶基因。鉴于TNF-α为UC乃至IBD发病的关键的细胞因子之一［12-14］，且其单克隆抗体抑制TNF-α已经成为UC生物治疗的重要临床方法
［15-17］，进一步明确是否在UC中miR-19a也是通过作用于TNF-α及下游信号通路发挥作用，有助于明确其发病机理及探索安全、有效的治疗手段。